Обратная транскриптаза

Обратная транскриптаза — это фермент класса трансфераз, который катализирует синтез дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) на матрице рибонуклеиновой кислоты (РНК). Данный процесс, называемый обратной транскрипцией, противоречит центральной догме молекулярной биологии, согласно которой генетическая информация передаётся от ДНК к РНК, а затем к белку. Обратная транскриптаза обнаружена у ретровирусов, ретротранспозонов, некоторых ДНК-содержащих вирусов, а также у эукариотических клеток (в частности, в процессе репликации теломер). Фермент играет ключевую роль в жизненном цикле ретровирусов, таких как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), и является важнейшей мишенью для антиретровирусной терапии.

История открытия

Возможность синтеза ДНК на РНК-матрице была предсказана теоретически ещё в 1960-х годах, однако экспериментальное подтверждение было получено в 1970 году. Два независимых коллектива исследователей — Говард Темин и Дэвид Балтимор — одновременно опубликовали работы, в которых сообщили об обнаружении фермента, способного осуществлять обратную транскрипцию. Темин изучал вирус саркомы Рауса, вызывающий опухоли у кур, и предположил, что его РНК-геном может преобразовываться в ДНК-копию, которая затем встраивается в геном клетки-хозяина. Балтимор работал с вирусом лейкоза мышей. За открытие обратной транскриптазы в 1975 году Темин и Балтимор были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине (совместно с Ренато Дульбекко).

Структура и механизм действия

Ферментативная активность

Обратная транскриптаза обладает тремя основными ферментативными активностями:

1. РНК-зависимая ДНК-полимераза — синтезирует первую цепь ДНК (кДНК) на матрице РНК, используя в качестве затравки (праймера) транспортную РНК (тРНК) клетки-хозяина.
2. Рибонуклеаза H (RNase H) — разрушает РНК-цепь в образовавшемся гибриде РНК-ДНК, оставляя короткие фрагменты РНК, которые служат праймерами для синтеза второй цепи.
3. ДНК-зависимая ДНК-полимераза — достраивает вторую цепь ДНК, используя первую цепь в качестве матрицы, в результате чего образуется двухцепочечная ДНК (провирусная ДНК).

Субъединичный состав

У разных вирусов обратная транскриптаза может быть гетеродимером (состоять из двух разных субъединиц) или мономером. Например, у ВИЧ-1 фермент представляет собой гетеродимер, состоящий из субъединиц p66 (66 кДа) и p51 (51 кДа). Субъединица p66 содержит все три активных центра, а p51 выполняет структурную роль, стабилизируя комплекс.

Процесс обратной транскрипции

Процесс включает несколько этапов:

1. Инициация: к РНК-геному вируса присоединяется клеточная тРНК, которая служит праймером.
2. Элонгация: фермент синтезирует первую цепь ДНК, двигаясь по РНК-матрице.
3. Деградация РНК: активность RNase H разрушает РНК-цепь, за исключением коротких фрагментов (пуриновых последовательностей), которые используются как праймеры.
4. Синтез второй цепи: ДНК-зависимая ДНК-полимераза достраивает вторую цепь, используя оставшиеся РНК-фрагменты.
5. Завершение: образуется двухцепочечная провирусная ДНК, которая затем транспортируется в ядро и интегрируется в геном клетки-хозяина с помощью фермента интегразы.

Классификация

Обратные транскриптазы классифицируют по происхождению и структуре:

• Вирусные обратные транскриптазы: наиболее изучены, обнаружены у ретровирусов (ВИЧ, HTLV, вирус лейкоза мышей), гепаднавирусов (вирус гепатита B) и некоторых других.
• Ретротранспозонные обратные транскриптазы: кодируются мобильными генетическими элементами (ретротранспозонами), которые способны перемещаться по геному через РНК-промежуточное звено.
• Теломеразная обратная транскриптаза (TERT): каталитическая субъединица теломеразы — фермента, достраивающего теломерные повторы на концах хромосом. TERT использует собственную встроенную РНК-матрицу.
• Обратные транскриптазы бактерий и архей: обнаружены у некоторых прокариот, например, в ретроинтронах и ретроэлементах.

Применение в биотехнологии

Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР)

Одним из важнейших применений обратной транскриптазы является метод обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Этот метод позволяет:

• Анализировать экспрессию генов путём количественного определения мРНК.
• Обнаруживать РНК-содержащие вирусы (например, ВИЧ, вирус гепатита C, коронавирус SARS-CoV-2).
• Синтезировать библиотеки кДНК для клонирования и секвенирования.

Синтез кДНК

Обратная транскриптаза используется для получения комплементарной ДНК (кДНК) из мРНК. Этот процесс лежит в основе создания библиотек кДНК, которые используются для изучения генома, поиска новых генов и производства рекомбинантных белков.

Секвенирование РНК

В современных методах секвенирования РНК (RNA-seq) обратная транскриптаза является ключевым ферментом, преобразующим РНК в стабильную двухцепочечную ДНК, пригодную для последующего анализа.

Медицинское значение

Мишень для антиретровирусных препаратов

Обратная транскриптаза ВИЧ является одной из основных мишеней для антиретровирусной терапии. Существует два класса ингибиторов этого фермента:

1. Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ): аналоги нуклеозидов, которые встраиваются в растущую цепь ДНК и блокируют её дальнейшее удлинение. Примеры: азидотимидин (зидовудин), ламивудин, тенофовир.
2. Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ННИОТ): связываются с аллостерическим центром фермента, изменяя его конформацию и подавляя активность. Примеры: невирапин, эфавиренз.

Резистентность

Мутации в гене обратной транскриптазы ВИЧ могут приводить к устойчивости вируса к ингибиторам. Это является серьёзной проблемой в лечении ВИЧ-инфекции и требует разработки новых препаратов и комбинированной терапии.

Интересные факты

• Открытие обратной транскриптазы опровергло центральную догму молекулярной биологии, которая изначально постулировала однонаправленный поток информации от ДНК к РНК.
• Фермент обладает низкой точностью копирования (частота ошибок около 1 на 10 000–100 000 нуклеотидов), что способствует высокой генетической изменчивости ретровирусов, таких как ВИЧ.
• Теломераза, содержащая обратную транскриптазную активность, играет ключевую роль в старении клеток и канцерогенезе. В большинстве соматических клеток человека теломераза неактивна, что приводит к укорочению теломер при каждом делении.
• Обратная транскриптаза используется в некоторых методах редактирования генома, например, в системе CRISPR-Cas с использованием обратной транскриптазы (CRISPR-Cas9 с RT) для вставки новых последовательностей ДНК.

Источники

• Baltimore D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses // Nature. — 1970. — Vol. 226, № 5252. — P. 1209–1211.
• Temin H. M., Mizutani S. RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus // Nature. — 1970. — Vol. 226, № 5252. — P. 1211–1213.
• Нобелевская лекция Г. Темина и Д. Балтимора, 1975.
• Lewin B. Genes VIII. — Pearson Prentice Hall, 2004. — Chapter 6: Transcription and Reverse Transcription.
• Sarafianos S. G., et al. Structure and function of HIV-1 reverse transcriptase: molecular mechanisms of polymerization and inhibition // Journal of Molecular Biology. — 2009. — Vol. 385, № 3. — P. 693–713.
• Blackburn E. H., Greider C. W., Szostak J. W. Telomeres and telomerase: the path from maize, Tetrahymena and yeast to human cancer and aging // Nature Medicine. — 2006. — Vol. 12, № 10. — P. 1133–1138.