Тиоредоксинредуктаза

Тиоредоксинредуктаза (TrxR) — это фермент класса оксидоредуктаз, катализирующий восстановление окисленного тиоредоксина (Trx) с использованием никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADPH) в качестве кофактора. Тиоредоксинредуктаза является ключевым компонентом тиоредоксиновой системы, которая регулирует клеточный окислительно-восстановительный баланс, участвует в защите от окислительного стресса, контролирует активность множества белков и влияет на процессы пролиферации, апоптоза и дифференцировки клеток. В зависимости от организма, фермент может иметь различную структуру и механизм действия, но в целом его функция высоко консервативна.

История открытия

Тиоредоксинредуктаза была впервые выделена и охарактеризована в 1960-х годах в лаборатории американского биохимика Эрла Стадтмана (Earl Stadtman) при изучении метаболизма серы у бактерий. В 1964 году группа учёных под руководством Л. С. Б. Холмгрена (L. S. B. Holmgren) и А. Холмгрена (A. Holmgren) в Каролинском институте (Швеция) описала тиоредоксин и его редуктазу из Escherichia coli. В 1970-х годах была установлена роль фермента в восстановлении рибонуклеотидов, необходимых для синтеза ДНК. В 1990-х годах были идентифицированы и охарактеризованы изоформы тиоредоксинредуктазы у млекопитающих, включая цитоплазматическую (TrxR1) и митохондриальную (TrxR2) формы, а также обнаружена её связь с селеном — фермент оказался селенсодержащим белком.

Структура и классификация

Тиоредоксинредуктазы относятся к семейству пиридин-нуклеотид-дисульфидоксидоредуктаз. По структуре и механизму действия выделяют три основных класса:

• Класс I (низкомолекулярные, бактериальные) — характерны для прокариот, архей и некоторых эукариот (например, дрожжей). Представляют собой гомодимеры с молекулярной массой около 35 кДа на субъединицу. Содержат флавинадениндинуклеотид (ФАД) и два активных центра — один с дисульфидной связью, другой с остатком цистеина. Механизм включает прямой перенос электронов от NADPH через ФАД на дисульфидный мостик, а затем на тиоредоксин.

• Класс II (высокомолекулярные, селенсодержащие) — встречаются у высших эукариот, включая млекопитающих, птиц и насекомых. Субъединицы имеют массу около 55–60 кДа. Отличительная особенность — наличие в активном центре селеноцистеина (Sec) на C-конце полипептидной цепи. Селен придаёт ферменту более высокую восстановительную способность и устойчивость к окислению. У человека известно три изоформы: цитоплазматическая TrxR1, митохондриальная TrxR2 и тиоредоксинредуктаза глутатионзависимая (TrxR3, также известная как TGR), экспрессирующаяся преимущественно в семенниках.

• Класс III (смешанные) — обнаружены у некоторых простейших (например, Plasmodium falciparum) и растений. По структуре занимают промежуточное положение между классами I и II, но могут иметь дополнительные домены или модификации.

Каталитический механизм

Реакция, катализируемая тиоредоксинредуктазой, протекает в два этапа:

1. Восстановление фермента: NADPH связывается с ФАД-содержащим доменом, передаёт два электрона на ФАД, который восстанавливается до ФАДН₂. Затем электроны переносятся на дисульфидный мостик в активном центре (Cys–Cys или Cys–Sec), восстанавливая его до двух тиоловых групп (–SH).

1. Восстановление тиоредоксина: Восстановленный фермент взаимодействует с окисленным тиоредоксином (Trx-S₂), передавая ему электроны. Тиоредоксин восстанавливается до дитиоловой формы (Trx-(SH)₂), а фермент возвращается в исходное окисленное состояние.

У селенсодержащих ферментов класса II селеноцистеин (Sec) в активном центре образует селенолят-анион (Se⁻), который является более сильным нуклеофилом, чем тиолят, что ускоряет реакцию и расширяет субстратную специфичность. Восстановленный тиоредоксин затем участвует в восстановлении дисульфидных связей в других белках, например, в рибонуклеотидредуктазе, пероксиредоксинах и факторах транскрипции.

Биологическая роль

Тиоредоксинредуктаза играет центральную роль в поддержании клеточного гомеостаза:

• Антиоксидантная защита: Восстановленный тиоредоксин является субстратом для пероксиредоксинов, которые нейтрализуют перекись водорода и органические гидропероксиды. Таким образом, тиоредоксинредуктаза косвенно участвует в детоксикации активных форм кислорода (АФК).

• Регуляция транскрипции: Тиоредоксин восстанавливает цистеиновые остатки в ДНК-связывающих доменах факторов транскрипции, таких как NF-κB, AP-1 и p53, что влияет на их активность и экспрессию генов, связанных с воспалением, пролиферацией и апоптозом.

• Синтез ДНК: Тиоредоксин является донором электронов для рибонуклеотидредуктазы — фермента, катализирующего превращение рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды, необходимые для репликации ДНК.

• Апоптоз: В митохондриях тиоредоксинредуктаза (TrxR2) и тиоредоксин-2 участвуют в регуляции высвобождения цитохрома c и активации каспаз, контролируя запуск программируемой клеточной гибели.

• Метаболизм селена: Тиоредоксинредуктаза сама является селенопротеином, и её активность зависит от доступности селена в организме. Она участвует в метаболизме селенсодержащих соединений, включая восстановление селенита до селенида.

Клиническое значение

Нарушения функции тиоредоксинредуктазы связаны с рядом заболеваний:

• Рак: Во многих опухолевых клетках наблюдается повышенная экспрессия тиоредоксинредуктазы и тиоредоксина, что способствует устойчивости к апоптозу и химиотерапии. Ингибиторы фермента (например, ауранофин, триоксид мышьяка, некоторые производные нитрофурана) исследуются как потенциальные противоопухолевые препараты. Ауранофин, используемый для лечения ревматоидного артрита, проявляет активность против ряда раковых клеток, связываясь с селеноцистеином в активном центре TrxR.

• Сердечно-сосудистые заболевания: Окислительный стресс играет роль в развитии атеросклероза и ишемии. Тиоредоксинредуктаза защищает эндотелий сосудов от повреждения, но её избыточная активность может способствовать ремоделированию сосудов.

• Нейродегенеративные расстройства: При болезни Альцгеймера, Паркинсона и боковом амиотрофическом склерозе наблюдается снижение активности тиоредоксинредуктазы и повышение окислительного стресса в нейронах. Восстановление её функции рассматривается как терапевтическая стратегия.

• Инфекционные заболевания: Некоторые патогены, например, Mycobacterium tuberculosis и Plasmodium falciparum, имеют собственную тиоредоксинредуктазу, отличную от человеческой, что делает её мишенью для разработки антибактериальных и противомалярийных препаратов.

• Дефицит селена: Поскольку тиоредоксинредуктаза является селенопротеином, недостаток селена в питании приводит к снижению её активности, что может усугублять окислительный стресс и способствовать развитию заболеваний, связанных с дефицитом селена (например, болезни Кешана и Кашина-Бека).

Ингибиторы и модуляторы

Известно несколько классов ингибиторов тиоредоксинредуктазы:

• Металлосодержащие соединения: Ауранофин (золотоорганическое соединение), триоксид мышьяка, цисплатин и их аналоги. Они взаимодействуют с селеноцистеином или цистеином в активном центре, необратимо блокируя фермент.

• Нитропроизводные: Нитрофураны, нитроимидазолы (например, метронидазол) и другие соединения с нитрогруппой, которые восстанавливаются ферментом с образованием токсичных радикалов.

• Природные соединения: Куркумин, ресвератрол, кверцетин и некоторые другие полифенолы могут ингибировать TrxR, хотя их специфичность и механизм действия до конца не изучены.

• Алкилирующие агенты: Хлорамбуцил, мелфалан и другие алкилирующие противоопухолевые препараты также способны модифицировать активный центр фермента.

Методы исследования

Для изучения активности тиоредоксинредуктазы применяются:

• Спектрофотометрический метод (DTNB-тест): Основан на восстановлении 5,5′-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) (DTNB) до тионитробензоата, который поглощает при 412 нм. Фермент восстанавливает DTNB, и скорость реакции пропорциональна его активности.

• Иммуноферментный анализ (ELISA): Для количественного определения белка используются специфические антитела.

• Вестерн-блоттинг: Позволяет оценить уровень экспрессии разных изоформ TrxR в тканях.

• Генетические методы: Нокаутные мыши по генам Txnrd1 (TrxR1) и Txnrd2 (TrxR2) используются для изучения роли фермента в развитии и физиологии. Полный нокаут TrxR1 летален на ранних стадиях эмбриогенеза, что подчёркивает его необходимость для жизни.

Интересные факты

• Тиоредоксинредуктаза млекопитающих является одним из немногих ферментов, содержащих селеноцистеин (21-ю аминокислоту, кодируемую стоп-кодоном UGA). У бактерий и дрожжей селен в этом ферменте отсутствует, и его заменяет цистеин.
• В 2015 году было обнаружено, что тиоредоксинредуктаза может восстанавливать не только тиоредоксин, но и ряд других субстратов, включая глутатион, липоевую кислоту и некоторые ксенобиотики, что расширяет её роль в клеточном метаболизме.
• В растениях тиоредоксинредуктаза участвует в регуляции фотосинтеза, активируя ферменты цикла Кальвина в ответ на свет.