Агробактерия

Agrobacterium (агробактерия) — это род грамотрицательных почвенных бактерий из семейства Rhizobiaceae, обладающих уникальной способностью переносить свой генетический материал в геном растений, вызывая у них образование опухолей (корончатых галлов) или разрастание корней (волосатый корень). Являются важным объектом биотехнологии и генной инженерии растений.

Таксономия и систематика

Род Agrobacterium долгое время классифицировался как самостоятельный, однако молекулярно-филогенетические исследования конца XX — начала XXI века показали его близкое родство с бактериями рода Rhizobium. В современной систематике (по данным LPSN на 2024 год) большинство видов агробактерий реклассифицированы в роды Rhizobium, Ruegeria и Allorhizobium. Тем не менее, в научной литературе и практической биотехнологии по-прежнему широко используется историческое название «агробактерия».

Основные виды, с которыми работают исследователи:

• Agrobacterium tumefaciens (синоним Rhizobium radiobacter) — возбудитель корончатого галла.
• Agrobacterium rhizogenes (синоним Rhizobium rhizogenes) — вызывает заболевание «волосатый корень».
• Agrobacterium vitis — поражает виноград, вызывая опухоли на корнях и стеблях.
• Agrobacterium rubi — вызывает галлы на малине и ежевике.

История открытия

В 1907 году американские учёные Эрвин Смит и Чарльз Таунсенд впервые описали бактерию Bacterium tumefaciens как возбудителя корончатого галла у растений. В 1930-х годах было установлено, что опухоли могут развиваться без присутствия бактерий, что натолкнуло на мысль о передаче трансформирующего агента. В 1974 году группа исследователей под руководством Роберта Хесса обнаружила, что бактерия содержит плазмиду, ответственную за вирулентность. В 1977 году Марк Ван Монтегю и Йозеф Шелл доказали, что часть этой плазмиды (Т-ДНК) встраивается в хромосому растения. Это открытие заложило основы для использования агробактерий в генной инженерии.

Биологические особенности

Морфология

Агробактерии представляют собой палочковидные клетки размером 0,6–1,0 × 1,5–3,0 мкм, подвижные за счёт 1–6 перитрихальных жгутиков. Не образуют спор, грамотрицательные, факультативные анаэробы. На плотных питательных средах образуют круглые, выпуклые, слизистые колонии белого или кремового цвета.

Метаболизм

Хемоорганотрофы, способные использовать широкий спектр органических соединений. Оптимальная температура роста — 25–28 °C, pH — 6,0–7,0. В почве могут сохраняться длительное время, в том числе в ризосфере растений.

Механизм заражения растений

Ti-плазмида и Ri-плазмида

Ключевой элемент патогенности — большая конъюгативная плазмида (200–800 тыс. пар оснований). У A. tumefaciens она обозначается как Ti-плазмида (tumor-inducing), у A. rhizogenes — Ri-плазмида (root-inducing). Плазмида содержит:

• T-область (transferred DNA) — участок, который встраивается в геном растения. В ней находятся гены, кодирующие синтез ауксинов, цитокининов и опинов.
• vir-область (virulence) — гены, обеспечивающие перенос T-ДНК, но сами не переносящиеся.
• Гены катаболизма опинов — позволяют бактерии использовать опины, синтезируемые растением, как источник углерода и азота.

Этапы переноса T-ДНК

1. Распознавание растения: бактерия чувствует фенольные соединения (например, ацетосирингон), выделяемые растением через ранки.
2. Активация vir-генов: фенольные соединения активируют VirA/VirG-систему двухкомпонентной регуляции.
3. Образование T-комплекса: белки VirD2 и VirC2 разрезают T-ДНК по граничным последовательностям (border repeats), образуя одноцепочечную молекулу (T-цепь).
4. Транспорт через клеточную стенку: T-цепь в комплексе с белками VirD2, VirE2 и другими проходит через систему секреции IV типа (T4SS) в клетку растения.
5. Транспорт в ядро: комплекс T-ДНК с белками проникает в ядро растительной клетки.
6. Интеграция: с помощью белков VirD2 и растительных репарационных систем T-ДНК встраивается в хромосому растения.

Последствия для растения

Встроенные гены вызывают:

• Гиперпродукцию ауксинов (индолил-3-уксусной кислоты) и цитокининов — неконтролируемое деление клеток → образование опухоли (галла).
• Синтез опинов — производных аминокислот и сахаров, которые могут использовать только агробактерии, содержащие соответствующие плазмиды.

Виды заболеваний

Корончатый галл

Вызывается A. tumefaciens. Характеризуется образованием на корнях, корневой шейке, стеблях и листьях растений наростов (галлов) различной формы и размера — от мелких бугорков до крупных образований диаметром более 10 см. Галлы имеют шероховатую поверхность, сначала светлые, затем темнеют и загнивают. Заболевание поражает более 600 видов растений, включая плодовые (яблоня, груша, персик, виноград), декоративные и овощные культуры.

Волосатый корень

Вызывается A. rhizogenes. Проявляется в образовании на корнях или месте прививки множества тонких, сильно разветвлённых корней, напоминающих бороду. Чаще встречается у розоцветных, ивовых и сложноцветных.

Бактериальный рак винограда

Вызывается A. vitis. Поражает в основном виноград, вызывая опухоли на корнях и штамбах. Болезнь особенно опасна для молодых саженцев.

Распространение и экономическое значение

Агробактерии распространены повсеместно в почвах умеренного и тёплого климата. В России заболевания, вызываемые агробактериями, наиболее часто регистрируются в южных регионах (Краснодарский край, Ростовская область, Ставрополье), а также в Нечерноземье — в питомниках и садах.

Экономический ущерб складывается из:

• Снижения урожайности поражённых растений на 20–70%.
• Гибели молодых саженцев.
• Необходимости выкорчёвки и замены растений.
• Ограничений на экспорт посадочного материала.

Методы борьбы

Профилактика

• Использование здорового посадочного материала из сертифицированных питомников.
• Обработка корневой системы саженцев перед посадкой биопрепаратами (на основе Bacillus subtilis, Trichoderma).
• Соблюдение севооборота и удаление растительных остатков.

Агротехнические меры

• Удаление и уничтожение поражённых растений.
• Дезинфекция инструментов после обрезки.
• Известкование кислых почв (агробактерии предпочитают pH 6–7).

Химические средства

Прямых химических средств борьбы с агробактериями в полевых условиях не существует. В питомниках применяют обработку корней растворами антибиотиков (стрептомицин, тетрациклин) или бактерицидных препаратов.

Биологические методы

• Использование непатогенных штаммов Agrobacterium radiobacter (штамм K84), которые выделяют агроцин 84 — бактериоцин, подавляющий рост патогенных агробактерий.
• Применение антагонистических микроорганизмов (псевдомонады, бациллы).

Использование в биотехнологии

Главное значение агробактерий для науки и промышленности — их применение в качестве природного вектора для генетической трансформации растений.

Принцип метода

Патогенность агробактерий устраняется путём удаления генов, вызывающих опухоль (онкогенов), из T-области плазмиды. В освободившийся участок встраивают целевой ген (например, устойчивости к гербицидам, насекомым-вредителям, засухе). Затем такой модифицированной агробактерией заражают растительные ткани (листья, стебли, каллус). После интеграции T-ДНК в геном растения регенерируют целое растение из трансформированных клеток.

Преимущества метода

• Высокая эффективность переноса генов.
• Возможность переноса крупных фрагментов ДНК (до 150 тыс. пар оснований).
• Интеграция в геном растения в виде одной или нескольких копий.
• Возможность трансформации широкого круга двудольных растений.

Ограничения

• Трудности с трансформацией однодольных растений (злаков), хотя разработаны методы с использованием суперагробактерий или добавлением фенольных индукторов.
• Необходимость регенерации целого растения из единичной трансформированной клетки.
• Риск нежелательных эффектов из-за случайной интеграции T-ДНК.

Примеры трансгенных растений, полученных с помощью агробактерий

• Устойчивые к гербицидам (соя, кукуруза, хлопчатник) — гены EPSPS (глифосат) или PAT (глюфосинат).
• Устойчивые к насекомым (Bt-культуры) — гены токсинов Bacillus thuringiensis.
• С улучшенным качеством плодов (томаты с замедленным созреванием, «Flavr Savr»).
• Растения-биореакторы — синтезирующие фармацевтические белки (антитела, вакцины, факторы роста).
• Растения для фиторемедиации — накапливающие тяжёлые металлы или разлагающие токсиканты.

Интересные факты

• Агробактерия — единственный известный природный организм, способный к межцарственному переносу генов (от прокариот к эукариотам).
• В 2001 году в геноме некоторых сортов табака и сладкого картофеля были обнаружены фрагменты T-ДНК агробактерий, встроившиеся в ходе эволюции — так называемые «природные трансгены».
• Метод агробактериальной трансформации был разработан в 1980-х годах и до сих пор остаётся «золотым стандартом» генной инженерии растений.
• В 2013 году учёные из США и Китая впервые использовали агробактерию для редактирования генома растений с помощью системы CRISPR/Cas9.

Источники

• Smith E.F., Townsend C.O. A plant-tumor of bacterial origin // Science, 1907.
• Van Montagu M., Schell J. Ti plasmids of Agrobacterium tumefaciens as vectors for genetic engineering of plants // Nature, 1977.
• Gelvin S.B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool // Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2003.
• Tzfira T., Citovsky V. Agrobacterium: from biology to biotechnology // Springer, 2008.
• Nester E.W. Agrobacterium: nature's genetic engineer // Frontiers in Plant Science, 2015.
• Коваленко О.В., Шелудько Ю.В. Агробактериальная трансформация растений // Молекулярная биология, 2010.
• Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешённых к применению на территории Российской Федерации, 2024.