CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 — это технология редактирования геномов высших организмов, основанная на бактериальной адаптивной иммунной системе. Она позволяет вносить направленные изменения в последовательности ДНК (вырезать, вставлять или заменять фрагменты) с высокой точностью, относительной простотой и низкой стоимостью по сравнению с более ранними методами (нуклеазы с «цинковыми пальцами» — ZFN, TALEN). Система состоит из двух ключевых компонентов: направляющей РНК (sgRNA), комплементарной целевому участку ДНК, и эндонуклеазы Cas9, которая вносит двухцепочечный разрыв в заданном локусе.

История открытия и развития

Ранние наблюдения (1987—2005)

В 1987 году японские учёные под руководством Ёсидзуми Исино при секвенировании гена iap у кишечной палочки (Escherichia coli) обнаружили необычные повторяющиеся последовательности, разделённые уникальными спейсерами. Эти структуры позже получили название CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами). В 2005 году независимо несколько групп исследователей (Ф. Мохика, К. Пур, А. Болотин) выявили, что спейсеры CRISPR имеют гомологию с ДНК бактериофагов и плазмид, что указывало на роль системы в приобретённом иммунитете прокариот.

Идентификация механизма (2005—2012)

В 2005—2007 годах была установлена связь CRISPR с генами cas (CRISPR-associated), кодирующими нуклеазы и хеликазы. В 2007 году группа Рода Баррангу (Danisco) экспериментально доказала, что Streptococcus thermophilus приобретает устойчивость к фагам, вставляя фрагменты фаговой ДНК в свой локус CRISPR. В 2011 году Эммануэль Шарпантье и Йеннифер Дудна показали, что система CRISPR/Cas9 у Streptococcus pyogenes состоит из двух РНК (crRNA и tracrRNA), которые вместе направляют Cas9 на расщепление ДНК-мишени. В 2012 году они же опубликовали работу, продемонстрировавшую, что объединение crRNA и tracrRNA в одну химерную направляющую РНК (sgRNA) позволяет программировать Cas9 на разрезание любой заданной последовательности ДНК in vitro.

Прорыв в редактировании генома эукариот (2013)

В январе 2013 года одновременно три группы (Чжан Фэн, Джордж Чёрч и группа из Кореи) сообщили об успешном применении CRISPR/Cas9 для редактирования генов в клетках человека и мыши. С этого момента началось стремительное распространение технологии в биологии и медицине. За открытие CRISPR/Cas9 Эммануэль Шарпантье и Йеннифер Дудна были удостоены Нобелевской премии по химии в 2020 году.

Устройство и механизм работы

Компоненты системы

1. Белок Cas9 — эндонуклеаза, содержащая два каталитических домена: HNH (разрезает цепь ДНК, комплементарную sgRNA) и RuvC (разрезает противоположную цепь). В природе Cas9 распознаёт короткую консервативную последовательность — PAM (Protospacer Adjacent Motif), расположенную рядом с целевым сайтом. Для S. pyogenes PAM — это NGG (где N — любой нуклеотид).
2. Направляющая РНК (sgRNA) — синтетическая молекула, объединяющая crRNA (содержит 20-нуклеотидную спейсерную последовательность, комплементарную мишени) и tracrRNA (необходима для связывания с Cas9). Смена спейсерной последовательности позволяет перенаправить Cas9 на любой участок генома, содержащий PAM.
3. ДНК-мишень — участок генома, комплементарный спейсеру sgRNA и примыкающий к PAM.

Этапы редактирования

1. Связывание: Комплекс Cas9-sgRNA сканирует ДНК и связывается с последовательностью, комплементарной спейсеру, при условии наличия PAM.
2. Разрезание: Cas9 вносит двухцепочечный разрыв (DSB) в ДНК на 3 нуклеотида выше PAM.
3. Восстановление разрыва: Клетка активирует один из двух путей репарации:

• Негомологичное соединение концов (NHEJ): основной путь, часто приводящий к вставкам или делециям (инделям) случайного размера. Это вызывает сдвиг рамки считывания и нокаут гена.
• Гомологичная репарация (HDR): происходит при наличии донорной матрицы (фрагмента ДНК с гомологичными концами). Позволяет вставить определённую последовательность (например, репортёрный ген или коррекцию мутации) в место разрыва.

Модификации Cas9

Для расширения возможностей технологии были созданы варианты Cas9:

• dCas9 (dead Cas9, каталитически неактивный) — мутант, теряющий нуклеазную активность, но сохраняющий способность связываться с ДНК. Используется для подавления (CRISPRi) или активации (CRISPRa) транскрипции, визуализации геномных локусов.
• Cas9 Nickase (Cas9n) — мутант с одной активной каталитической областью, вносящий одноцепочечный разрыв (ник). Используется для снижения нецелевых эффектов.
• ABE/CBE (аденин- и цитозин-основные редакторы) — гибриды dCas9/Cas9n с деаминазами, позволяющие заменять одно основание (A→G, C→T) без разрыва двойной цепи.
• Prime editors — гибриды Cas9n с обратной транскриптазой, способные вносить короткие вставки, делеции или замены по матрице, зашитой в направляющую РНК (pegRNA).

Применение

Фундаментальные исследования

• Нокаут генов: быстрая инактивация любого гена в клеточных линиях или модельных организмах (мыши, рыбы, растения) для изучения его функции.
• Создание репортёрных линий: встраивание генов флуоресцентных белков (GFP, RFP) под контроль эндогенных промоторов.
• Геномный скрининг: библиотеки sgRNA, нацеленные на все гены генома, позволяют выявлять гены, связанные с устойчивостью к лекарствам, пролиферацией или дифференцировкой.

Сельское хозяйство

• Улучшение культур: создание сортов растений с повышенной урожайностью, устойчивостью к засухе, болезням и вредителям (например, грибы с пониженным потемнением, соя с улучшенным жирнокислотным составом).
• Животноводство: получение животных с улучшенными мясными и молочными качествами, устойчивостью к вирусным инфекциям (например, свиньи, устойчивые к репродуктивно-респираторному синдрому).

Медицина и биотехнология

• Генная терапия (экспериментально):
• Серповидно-клеточная анемия и бета-талассемия: реактивация фетального гемоглобина путём нокаута гена BCL11A в гемопоэтических стволовых клетках (клинические испытания NCT03745287).
• Муковисцидоз: коррекция мутации ΔF508 в гене CFTR (доклинические исследования).
• ВИЧ: вырезание провирусной ДНК из генома инфицированных клеток или нокаут рецептора CCR5 (случай «пекинских близнецов» в 2018 году, вызвавший этический скандал).
• Онкология: создание CAR-T-клеток с нокаутом генов, подавляющих иммунный ответ (PD-1, CTLA-4), для повышения эффективности иммунотерапии.
• Диагностика: система SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing) на основе Cas13a позволяет выявлять РНК вирусов (включая SARS-CoV-2) с аттомолярной чувствительностью.

Ограничения и этические вопросы

Технические ограничения

• Нецелевые эффекты (off-target): Cas9 может разрезать сайты, частично гомологичные sgRNA, особенно при наличии нескольких несовпадений в PAM-дистальной области. Это может приводить к нежелательным мутациям.
• Мозаицизм: при редактировании эмбрионов на ранних стадиях (зигота) изменения могут возникать не во всех клетках, что ведёт к мозаичному генотипу.
• Эффективность HDR: гомологичная репарация в соматических клетках происходит с низкой частотой (обычно 1–10%), что затрудняет точное встраивание генов.
• Иммуногенность: белок Cas9 из S. pyogenes может вызывать иммунный ответ у человека, что снижает эффективность повторного введения.

Этические и регуляторные проблемы

• Редактирование зародышевой линии: вмешательство в геном эмбрионов человека (сперматозоиды, яйцеклетки, зиготы) изменяет ДНК, которая передаётся следующим поколениям. Это сопряжено с риском непредсказуемых долгосрочных последствий и вызывает серьёзные этические дебаты. В большинстве стран (включая Россию) такое редактирование запрещено или строго ограничено.
• Улучшение человека: возможность редактировать гены, связанные с когнитивными способностями, физическими данными или внешностью, порождает вопросы социального неравенства и евгеники.
• Биобезопасность: технология потенциально может быть использована для создания биологического оружия (патогенов с изменёнными свойствами).

Интересные факты

• В 2018 году китайский учёный Хэ Цзянькуй объявил о рождении первых в мире генетически модифицированных людей — близнецов Лулу и Нана, у которых был нокаутирован ген CCR5 для устойчивости к ВИЧ. Это привело к международному осуждению и уголовному преследованию учёного.
• Система CRISPR/Cas9 была первоначально обнаружена у бактерий Streptococcus pyogenes (возбудителя ангины), но с тех пор были найдены и охарактеризованы сотни других вариантов Cas9 и Cas12a (Cpf1) с разными PAM-последовательностями и свойствами.
• Термин «CRISPR» был предложен в 2002 году группой Рютара Янагава (Нидерланды) и Франсиско Мохики (Испания).

Источники

• Jinek M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 2012.
• Cong L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 2013.
• Mali P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 2013.
• Doudna J. A., Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science, 2014.
• Hsu P. D., Lander E. S., Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell, 2014.
• Komor A. C. et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 2016.
• Anzalone A. V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature, 2019.
• Cyranoski D. The CRISPR-baby scandal: what’s next for human gene-editing. Nature, 2019.