Hi-C

Hi-C — это метод молекулярной биологии, основанный на секвенировании ДНК, который позволяет изучать трёхмерную (3D) организацию хроматина в клеточном ядре. Метод выявляет пространственные контакты между различными участками генома, включая взаимодействия между регуляторными элементами (например, энхансерами и промоторами), а также определяет топологию хромосомных доменов (TAD-доменов). Hi-C используется для построения карт контактов хроматина с высоким разрешением и является ключевым инструментом в эпигеномике и функциональной геномике.

История развития метода

Метод Hi-C был впервые описан в 2009 году группой исследователей под руководством Джоба Деккера (Job Dekker) и Ника ван Беркела (Niek van Berkum) в статье, опубликованной в журнале Science. Разработка стала продолжением более раннего метода 3C (Chromosome Conformation Capture), предложенного Деккером в 2002 году. В отличие от 3C, который анализирует контакты между двумя конкретными локусами, Hi-C позволяет одновременно изучать все возможные парные взаимодействия в геноме. Это стало возможным благодаря внедрению этапа лигирования с последующим высокопроизводительным секвенированием.

Ключевое усовершенствование метода — введение биотинилированных нуклеотидов на этапе репарации концов ДНК, что позволяет селективно выделять фрагменты, содержащие точки лигирования. В 2010-х годах метод был адаптирован для различных организмов, включая человека, мышь, дрозофилу, а также для растений и бактерий. Дальнейшее развитие привело к появлению вариантов, таких как Micro-C (с использованием микрококковой нуклеазы для более высокого разрешения) и HiChIP (комбинация Hi-C с иммунопреципитацией хроматина).

Принцип метода

Основные этапы

1. Фиксация клеток. Клетки обрабатывают формальдегидом, который ковалентно сшивает белки и ДНК, «замораживая» пространственные взаимодействия хроматина.
2. Рестрикция. Хроматин разрезают рестриктазой (часто используют HindIII или DpnII), которая расщепляет ДНК в местах, не защищённых белками.
3. Биотинилирование концов. К концам фрагментов ДНК добавляют биотинилированные нуклеотиды с помощью ДНК-полимеразы I (фрагмент Кленова). Это позволяет впоследствии выделить контактирующие фрагменты.
4. Лигирование. Фрагменты ДНК лигируют в условиях низкой концентрации ДНК, что способствует образованию связей между физически близкими, но генетически удалёнными участками. Образуются химерные молекулы, соединяющие два ранее удалённых локуса.
5. Обработка и очистка. Сшивки разрушают, ДНК очищают и фрагментируют (например, ультразвуком). Биотинилированные фрагменты извлекают с помощью стрептавидиновых магнитных шариков.
6. Секвенирование. Полученные библиотеки секвенируют (обычно парно-концевым методом). Каждый прочтённый фрагмент состоит из двух «ног» (англ. legs), соответствующих двум взаимодействовавшим локусам.

Анализ данных

После секвенирования данные выравнивают на референсный геном. Для каждой пары концов (read pair) определяют координаты двух локусов. Частота таких пар между двумя участками генома отражает частоту их пространственного контакта. Результат представляют в виде матрицы контактов, где строки и столбцы соответствуют участкам хроматина, а значения ячеек — числу наблюдаемых взаимодействий. Для визуализации используют тепловые карты (Hi-C-карты), на которых тёмные области соответствуют частым контактам.

Классификация и варианты метода

По разрешению

• Низкое разрешение (1–10 Мб). Используется для изучения общей архитектуры ядра, например, деления на А- и В-компартменты (активный и неактивный хроматин).
• Среднее разрешение (100–500 кб). Позволяет выявлять топологически ассоциированные домены (TAD-домены) — структурные единицы хроматина длиной от 100 до 1000 кб.
• Высокое разрешение (< 10 кб). Требует глубокого секвенирования (миллиарды прочтений) и позволяет анализировать петли хроматина, формируемые белками CTCF и когезином.

По модификациям протокола

• Micro-C. Использует микрококковую нуклеазу вместо рестриктазы, что позволяет получать фрагменты ДНК длиной 100–300 пар оснований. Обеспечивает разрешение до одной нуклеосомы.
• HiChIP. Сочетает Hi-C с иммунопреципитацией хроматина (ChIP-seq). Позволяет выявлять контакты только тех участков, которые связаны с определённым белком (например, H3K27ac или CTCF).
• Capture-C (или Capture Hi-C). Использует гибридизационные пробы для обогащения библиотек по целевым локусам (например, промоторам генов). Увеличивает чувствительность для изучения конкретных регуляторных взаимодействий.
• Single-cell Hi-C. Адаптирован для анализа единичных клеток, что позволяет изучать гетерогенность 3D-организации генома в популяции.

Применение

Изучение архитектуры генома

Hi-C подтвердил, что хромосомы в ядре не перемешаны хаотично, а организованы в хромосомные территории. Внутри каждой территории выделяют два компартмента: А-компартмент (эухроматин, активные гены) и В-компартмент (гетерохроматин, неактивные гены). На более мелком масштабе метод выявил TAD-домены — структурные единицы, в пределах которых регуляторные элементы взаимодействуют друг с другом, но изолированы от соседних доменов.

Функциональная геномика

Hi-C используется для картирования регуляторных петель, соединяющих энхансеры и промоторы. Это помогает идентифицировать гены-мишени для некодирующих регуляторных элементов, в том числе для вариантов, ассоциированных с заболеваниями (GWAS-локусов). Например, с помощью Hi-C были установлены связи между однонуклеотидными полиморфизмами (SNP) в некодирующих областях и генами, ответственными за предрасположенность к раку или аутоиммунным заболеваниям.

Медицинские исследования

• Онкология. Hi-C выявляет хромосомные перестройки (транслокации, делеции, дупликации), характерные для раковых клеток. Метод также показывает изменения в 3D-организации генома при трансформации клеток, например, разрушение TAD-доменов, что может приводить к аберрантной активации онкогенов.
• Генетические заболевания. Нарушения в структуре TAD-доменов (например, делеции границ доменов) связывают с врождёнными пороками развития, такими как синдромы, вызванные мутациями в генах CTCF или RAD21.
• Нейробиология. Исследования показывают, что 3D-организация хроматина изменяется при нейродегенеративных заболеваниях (например, болезни Альцгеймера) и психических расстройствах.

Эволюционная биология

Сравнение Hi-C-карт разных видов (человека, мыши, дрозофилы, растений) позволяет изучать эволюцию трёхмерной архитектуры генома. Например, показано, что TAD-домены консервативны у млекопитающих, но менее стабильны у насекомых.

Критика и ограничения

• Высокая стоимость. Для получения карт высокого разрешения требуется глубокое секвенирование (до нескольких миллиардов прочтений), что делает метод дорогим.
• Технические артефакты. Лигирование может происходить не только между пространственно близкими, но и между случайно сблизившимися фрагментами, что требует сложной статистической обработки.
• Низкое разрешение для некоторых геномов. Для организмов с большими геномами (например, растений) или с высокой повторяемостью последовательностей (например, центромер) разрешение метода ограничено.
• Необходимость большого числа клеток. Стандартный Hi-C требует миллионов клеток, что затрудняет его применение для редких типов клеток (например, циркулирующих опухолевых клеток).
• Сложность интерпретации. Карты контактов отражают усреднённую картину по популяции клеток, что скрывает клеточную гетерогенность. Одноядерные варианты метода частично решают эту проблему.

Интересные факты

• Hi-C позволил впервые визуализировать так называемые «хромосомные территории» — зоны, которые каждая хромосома занимает в ядре. Это подтвердило гипотезу, выдвинутую Карлом Раблем ещё в 1885 году.
• Метод показал, что геном человека уложен в ядре таким образом, что участки, расположенные на одной хромосоме, контактируют друг с другом в 10–100 раз чаще, чем участки разных хромосом.
• В 2020 году с помощью Hi-C была построена карта 3D-организации генома коронавируса SARS-CoV-2, что помогло понять механизмы его репликации.
• Hi-C используется в криминалистике для идентификации личности по образцам ДНК с низким качеством (например, из волос или костей), так как метод позволяет получать информацию о пространственной структуре хроматина даже из фрагментированной ДНК.

Источники

• Lieberman-Aiden, E., van Berkum, N. L., Williams, L., et al. (2009). Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science, 326(5950), 289–293.
• Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., & Kleckner, N. (2002). Capturing chromosome conformation. Science, 295(5558), 1306–1311.
• Rao, S. S. P., Huntley, M. H., Durand, N. C., et al. (2014). A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell, 159(7), 1665–1680.
• Dixon, J. R., Selvaraj, S., Yue, F., et al. (2012). Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature, 485(7398), 376–380.
• Hsieh, T. H. S., Weiner, A., Lajoie, B. R., et al. (2015). Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by Micro-C. Cell, 162(1), 108–119.
• Mumbach, M. R., Rubin, A. J., Flynn, R. A., et al. (2016). HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods, 13(11), 919–922.