КОЭ в микробиологии¶
КОЭ (коэффициент обесцвечивания, англ. optical density, OD) — количественная мера мутности (турбидиметрии) жидкой микробной культуры, используемая для оценки числа клеток микроорганизмов в пробе. Значение КОЭ отражает степень рассеяния света клеточной суспензией и широко применяется в микробиологии, биотехнологии и медицинской диагностике как быстрый и недорогой метод определения плотности бактериальной, дрожжевой или иной культуры.
¶Физический принцип
Коэффициент обесцвечивания измеряют на спектрофотометре (фотометре). Пропускание света через кювету с суспензией микроорганизмов снижается за счёт рассеяния и поглощения света клетками. Согласно закону Бугера — Ламберта — Бера, при определённых условиях величина КОЭ пропорциональна концентрации клеток. На практике измерение проводят при длине волны 600 нм (КОЭ₆₀₀) — в этой области поглощение пигментами и компонентами среды минимально, а рассеяние клетками существенно. Для гемолизированных образцов или клеточных лизатов используют длину волны 540–570 нм.
Важно учитывать, что КОЭ отражает суммарное рассеяние, а не жизнеспособность: погибшие клетки, клеточные обломки и частицы среды также вносяют вклад в показание прибора. Для раздельного учёта жизнеспособных и нежизнеспособных клеток применяют посев на плотную среду, флуоресцентные красители (пропидий йодид, SYTO 9) или турбидиметрию в сочетании с фазово-контрастной микроскопией.
¶Методика измерения
Стандартная процедура включает следующие шаги:
- Отбор пробы из культуры (обычно 1 мл) в кювету стандартного объёма (1 см).
- Измерение оптической плотности на спектрофотометре при 600 нм.
- Снятие «нулевого» показания на стерильной среде (бланк) для компенсации поглощения средой и стеклом кюветы.
- При необходимости — разведение пробы стерильным физраствором или средой до попадания показания в линейный диапазон прибора (как правило, КОЭ < 0,8–1,0).
Для построения калибровочной кривой «КОЭ — число КОЕ/мл» серийные разведения культуры высевают на агар и подсчитывают колонии. Полученные данные позволяют в дальнейшем переводить измерения КОЭ в абсолютные концентрации клеток.
¶Применение
- Мониторинг роста культуры. Построение кривых роста (фазы лага, экспоненциального роста, стационарной фазы и гибели) по измерениям КОЭ в динамике.
- Стандартизация инокуля. Подготовка стандартного по плотности посевного материала для испытаний антибиотикочувствительности (метод разведения по Броди), вакцин, ферментативных реакций.
- Биотехнология. Контроль ферментационных процессов при производстве рекомбинантных белков, антибиотиков, аминокислот и других метаболитов.
- Медицинская микробиология. Быстрая оценка роста в посевах крови и других стерильных жидкостей (автоматические системы BACTEC, BacT/ALERT).
- Антибактериальная активность. Оценка эффективности антимикробных веществ по подавлению роста (турбидиметрические варианты теста Кирби — Бауэра и метода разведения).
¶Ограничения
Показатель КОЭ зависит от вида микроорганизма, размера и формы клеток, состояния среды, температуры и настроек прибора. Сравнение значений КОЭ между разными видами или приборами без калибровки некорректно. Высокая мутность (КОЭ > 1,0) выходит за линейный диапазон и требует разведения. Для дрожжей и крупных бактериальных клеток (например, Bacillus subtilis) зависимость «КОЭ — число клеток» отличается от таковой для мелких кокков (Escherichia coli).
¶Связанные методы
Альтернативой КОЭ являются прямой подсчёт клеток в камере Горяева или камере Петрова — Тома, флуориметрия с красителями ДНК, измерение турбидиметрии в ИК-диапазоне (приборы для определения биомассы дрожжей), а также токсикометрия (определение токсигенности Clostridium botulinum по мутности среды).
¶Историческая справка
Турбидиметрические методы оценки роста микроорганизмов получили распространение в 1920–1930-х годах. В 1937 году Дж. Ламанна предложил использовать измерения мутности для определения токсигенности клостридий. В 1960-е годы метод был стандартизован для контроля качества вакцин. С развитием автоматических биореакторов измерение КОЭ стало неотъемлемой частью систем управления ферментацией.
¶Источники
- Brock Biology of Microorganisms / M.T. Madigan, D.A. Stahl, J.M. Martinko. — 15th ed. — Pearson, 2018.
- Микробиология: учебник / под ред. А.С. Лабинской. — М.: ГЭОТАР-Медиа.
- Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Клинические рекомендации МЗ РФ.
- Биохимические методы исследования в микробиологии / под ред. В.Д. Бондаренко. — М.: Медицина.