Количественная ПЦР в реальном времени

Количественная ПЦР в реальном времени (англ. Real-Time Quantitative PCR, qPCR, RT-qPCR) — это метод молекулярной биологии, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет одновременно амплифицировать (умножать) целевые фрагменты ДНК и измерять их количество в процессе реакции. В отличие от классической ПЦР с детекцией по конечной точке, qPCR регистрирует накопление ампликонов в реальном времени на каждом цикле, что даёт возможность не только определить наличие, но и точно рассчитать исходное количество исследуемой нуклеотидной последовательности в образце. Метод широко применяется в фундаментальных исследованиях, клинической диагностике, фармацевтике и биотехнологии.

История

Основы метода были заложены в 1980-х годах после открытия ПЦР Кэри Муллисом (Нобелевская премия 1993 года). Первоначально ПЦР была полуколичественным методом: количество продукта оценивалось после завершения всех циклов с помощью гель-электрофореза. В 1992 году японский учёный Рюдзо Хигути предложил использовать флуоресцентные зонды для детекции накопления ДНК в реальном времени. В 1993 году он опубликовал первую работу по количественному анализу с помощью ПЦР с флуоресцентным детектированием. В 1996 году компания Applied Biosystems (США) выпустила первый коммерческий прибор для qPCR — ABI Prism 7700 Sequence Detection System, что сделало метод доступным для широкого круга лабораторий. В последующие годы были разработаны различные типы флуоресцентных красителей и зондов, а также математические модели для расчёта исходной концентрации, такие как метод порогового цикла (Ct).

Принцип метода

Основу qPCR составляет стандартная ПЦР, в ходе которой происходит многократное копирование (амплификация) целевого участка ДНК. Однако в qPCR в реакционную смесь добавляют флуоресцентные метки, интенсивность свечения которых пропорциональна количеству накопленного продукта. Детекция флуоресценции проводится на каждом цикле амплификации с помощью оптической системы прибора.

Флуоресцентные метки

Существует два основных типа флуоресцентных меток:

1. Интеркалирующие красители (например, SYBR Green I, EvaGreen). Эти молекулы связываются с двухцепочечной ДНК, и при возбуждении светом они испускают флуоресценцию. По мере накопления ампликонов количество связанного красителя растёт, что приводит к увеличению сигнала. Недостаток метода — неспецифичность: краситель связывается с любой двухцепочечной ДНК, включая неспецифические продукты (праймер-димеры). Для повышения специфичности используют анализ кривых плавления (melting curve analysis).

1. Флуоресцентно-меченые зонды (гидролизуемые зонды TaqMan, молекулярные маячки, Scorpion-зонды). Эти зонды представляют собой короткие олигонуклеотиды, комплементарные внутреннему участку целевой последовательности. Зонд содержит флуорофор и гаситель (quencher) на разных концах. В исходном состоянии флуоресценция подавлена из-за близости гасителя. В ходе элонгации цепи ДНК-полимераза, обладающая 5'-экзонуклеазной активностью, гидролизует зонд, отделяя флуорофор от гасителя, что приводит к увеличению флуоресценции. Использование зондов обеспечивает высокую специфичность, так как сигнал регистрируется только при гибридизации зонда с целевой последовательностью.

Пороговый цикл (Ct)

Ключевым параметром в qPCR является пороговый цикл (Cycle Threshold, Ct). Ct — это номер цикла, на котором флуоресцентный сигнал от образца превышает фоновый уровень (пороговое значение). Чем меньше исходное количество целевой ДНК в образце, тем больше циклов требуется для достижения порога, и тем выше значение Ct. Связь между Ct и исходной концентрацией является обратно пропорциональной и логарифмической. Для абсолютного количественного определения используют калибровочную кривую, построенную по образцам с известной концентрацией. Для относительного количественного определения используют метод ΔΔCt, где Ct целевого гена нормализуют по Ct референсного (контрольного) гена, уровень экспрессии которого считается стабильным.

Виды количественной ПЦР

Абсолютная количественная ПЦР

Цель — определить точное количество копий целевой ДНК в образце (например, число вирусных частиц в 1 мл плазмы). Для этого строится калибровочная кривая с использованием стандартных образцов с известной концентрацией (например, плазмид с клонированным целевым фрагментом). По Ct исследуемого образца с помощью кривой рассчитывают количество копий. Метод широко используется в вирусологии для определения вирусной нагрузки при ВИЧ-инфекции, гепатитах B и C, а также в генетике для оценки числа копий генов.

Относительная количественная ПЦР

Цель — сравнить уровень экспрессии гена (количество мРНК) в разных образцах (например, в здоровой и опухолевой ткани). Для этого сначала проводят обратную транскрипцию (RT) мРНК в кДНК, а затем qPCR. Результат выражается в виде кратности изменения (fold change) относительно контрольного образца. Для нормализации используют референсные гены (например, GAPDH, ACTB, 18S рРНК), уровень экспрессии которых считается постоянным. Метод ΔΔCt является наиболее распространённым.

Мультиплексная qPCR

Позволяет одновременно амплифицировать и детектировать несколько целевых последовательностей в одной пробирке. Для этого используют зонды, меченные разными флуорофорами с неперекрывающимися спектрами излучения. Мультиплексная qPCR применяется для скрининга генетических мутаций, идентификации патогенов и в судебно-медицинской экспертизе.

Применение

Медицинская диагностика

qPCR является золотым стандартом для диагностики многих инфекционных заболеваний. В период пандемии COVID-19 метод RT-qPCR (обратная транскрипция с последующей qPCR) использовался для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2. Также метод применяется для диагностики ВИЧ, гепатитов, туберкулёза, герпесвирусных инфекций, хламидиоза и других заболеваний. В онкологии qPCR используется для выявления циркулирующей опухолевой ДНК (ctDNA) в крови (жидкостная биопсия), а также для оценки экспрессии онкогенов и генов-супрессоров.

Генетика и геномика

Метод применяется для определения числа копий генов (CNV), анализа экспрессии генов, генотипирования (например, SNP-анализ), а также для валидации данных, полученных с помощью микрочипов и секвенирования нового поколения (NGS).

Биотехнология и фармацевтика

В биотехнологии qPCR используется для контроля качества продуктов (например, обнаружение остаточной ДНК-примеси в рекомбинантных белках), для количественной оценки рекомбинантных плазмид, а также для мониторинга эффективности генной терапии. В фармацевтике метод применяется при разработке и тестировании лекарственных препаратов, в том числе для оценки их токсичности и фармакокинетики.

Пищевая промышленность и экология

qPCR используется для выявления генетически модифицированных организмов (ГМО) в продуктах питания, для идентификации видов мяса и рыбы, а также для мониторинга патогенных микроорганизмов в воде и почве.

Преимущества и ограничения

Преимущества

• Высокая чувствительность: позволяет обнаруживать единичные копии целевой ДНК.
• Широкий динамический диапазон: возможность количественного анализа в диапазоне 7-8 порядков (от 1 до 10^8 копий).
• Высокая специфичность: особенно при использовании флуоресцентных зондов.
• Количественная точность: возможность как абсолютного, так и относительного определения.
• Быстрота: анализ занимает от 1 до 3 часов.
• Отсутствие пост-амплификационных стадий: детекция происходит в закрытой системе, что снижает риск контаминации.

Ограничения

• Необходимость в дорогостоящем оборудовании и реагентах: для qPCR требуется амплификатор с оптической системой детекции и флуоресцентные зонды.
• Чувствительность к ингибиторам: компоненты образца (например, гемоглобин, гепарин, гуминовые кислоты) могут подавлять реакцию, что приводит к занижению результатов.
• Необходимость в качественных праймерах и зондах: неправильный дизайн может привести к неспецифической амплификации или отсутствию сигнала.
• Ограниченная мультиплексность: в одной реакции обычно детектируют не более 4-6 целевых последовательностей из-за перекрывания спектров флуорофоров.
• Зависимость от эталонных образцов: для абсолютного количественного определения требуются калибровочные стандарты, а для относительного — стабильные референсные гены.

Интересные факты

• Термин «пороговый цикл» (Ct) был введён в 1996 году компанией Applied Biosystems и стал общепринятым.
• В 2020 году, в разгар пандемии COVID-19, объём мирового рынка реагентов и оборудования для qPCR вырос в несколько раз, а сам метод стал известен широкой публике.
• Современные приборы для qPCR могут одновременно анализировать до 384 или 1536 образцов в одном прогоне, что позволяет проводить высокопроизводительный скрининг.
• Существуют портативные версии qPCR-амплификаторов, которые используются для полевой диагностики инфекций в удалённых регионах.

Источники

1. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., & Watson, R. (1993). Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Bio/Technology, 11(9), 1026-1030.
2. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., & Williams, P. M. (1996). Real time quantitative PCR. Genome Research, 6(10), 986-994.
3. Livak, K. J., & Schmittgen, T. D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 25(4), 402-408.
4. Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggett, J., Kubista, M., ... & Wittwer, C. T. (2009). The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry, 55(4), 611-622.
5. Mackay, I. M. (2004). Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clinical Microbiology and Infection, 10(3), 190-212.