Кристаллизация белков

Кристаллизация белков — это процесс перехода белковых молекул из раствора в твёрдую фазу с образованием упорядоченной трёхмерной кристаллической решётки. В отличие от кристаллизации низкомолекулярных соединений, кристаллизация белков является сложной многофакторной задачей, требующей тонкого контроля физико-химических параметров. Полученные белковые кристаллы используются преимущественно для определения пространственной структуры белка методом рентгеновской кристаллографии, а также в некоторых областях биофармацевтики и биотехнологии.

История

Первые сообщения о кристаллизации белков относятся к середине XIX века. В 1840 году немецкий химик Фридрих Людвиг Хюнефельд (Friedrich Ludwig Hünefeld) наблюдал кристаллы гемоглобина из крови дождевого червя. В 1851 году Карл Людвиг (Carl Ludwig) и Александр Шмидт (Alexander Schmidt) получили кристаллы гемоглобина из крови млекопитающих. Однако систематическое изучение кристаллизации белков началось лишь в конце XIX — начале XX века. В 1894 году Франц Хофмейстер (Franz Hofmeister) и Эмиль Фишер (Emil Fischer) независимо друг от друга описали кристаллизацию яичного альбумина и некоторых других белков.

Ключевым прорывом стало применение рентгеновской кристаллографии к белкам. В 1934 году Джон Бернал (John Desmond Bernal) и Дороти Ходжкин (Dorothy Hodgkin) получили первую рентгенограмму кристалла пепсина, что доказало принципиальную возможность определения структуры белков этим методом. В 1958 году Макс Перуц (Max Perutz) и Джон Кендрю (John Kendrew) расшифровали трёхмерную структуру миоглобина и гемоглобина, за что в 1962 году получили Нобелевскую премию по химии. С тех пор кристаллизация белков стала стандартным инструментом структурной биологии.

Теоретические основы

Природа белковых кристаллов

Белковые кристаллы принципиально отличаются от кристаллов неорганических солей или органических молекул. Белок — это макромолекула с молекулярной массой от нескольких тысяч до миллионов дальтон. Кристаллическая решётка формируется за счёт слабых нековалентных взаимодействий: водородных связей, ионных связей, вандерваальсовых сил, гидрофобных контактов. В результате кристаллы белков содержат большое количество растворителя (до 30–80 % объёма), что делает их механически хрупкими и чувствительными к изменениям условий.

Фазовые диаграммы

Кристаллизация белка описывается фазовой диаграммой, на которой выделяют зоны растворимости, метастабильности (пересыщения) и лабильности. В зоне метастабильности возможен рост кристаллов, но не происходит спонтанного зарождения. В зоне лабильности возможно как зарождение, так и рост. Для успешной кристаллизации необходимо создать условия пересыщения, но не настолько сильного, чтобы выпал аморфный осадок.

Методы кристаллизации

Существует несколько основных методов, применяемых для кристаллизации белков. Выбор метода зависит от свойств конкретного белка, доступного количества образца и целей эксперимента.

Диффузия паров (метод висячей капли)

Наиболее распространённый метод. Капля раствора белка с осадителем помещается на покровное стекло, которое переворачивается и герметизируется над резервуаром с раствором осадителя более высокой концентрации. В замкнутой системе происходит диффузия паров воды, что приводит к постепенному увеличению концентрации белка и осадителя в капле, достигая зоны пересыщения.

Диффузия в геле

Метод используется для снижения конвекции и улучшения качества кристаллов. Растворы белка и осадителя разделены слоем геля (агароза, кремнезём). Диффузия через гель замедляет процесс, позволяя получать более крупные и однородные кристаллы.

Микродиализ

Раствор белка помещается в диализный мешочек или камеру, которая погружается в большой объём раствора осадителя. Через полупроницаемую мембрану медленно выравниваются концентрации низкомолекулярных компонентов, что приводит к постепенному пересыщению.

Свободное испарение

Простой метод, при котором раствор белка оставляют открытым для медленного испарения воды. Используется редко из-за трудности контроля и высокой вероятности аморфного осаждения.

Кристаллизация в микропотоке (микрофлюидика)

Современный высокопроизводительный метод. Растворы белка и осадителя смешиваются в микрофлюидных чипах с контролируемым потоком. Позволяет проводить сотни экспериментов с минимальным расходом белка (до нескольких микролитров на каплю).

Факторы, влияющие на кристаллизацию

Концентрация белка

Оптимальная концентрация белка обычно составляет 5–50 мг/мл, но может варьировать. Слишком низкая концентрация не даёт пересыщения, слишком высокая — ведёт к аморфному осаждению.

Тип и концентрация осадителя

Осадители (соли, полиэтиленгликоли, органические растворители) снижают растворимость белка. Наиболее распространены: сульфат аммония, хлорид натрия, ПЭГ 4000–8000, 2-метил-2,4-пентандиол (МПД). Концентрация подбирается эмпирически.

pH раствора

pH влияет на заряд поверхности белка и его растворимость. Кристаллизация часто происходит вблизи изоэлектрической точки белка, где его растворимость минимальна. Диапазон pH обычно 4–9.

Температура

Температура влияет на растворимость, скорость диффузии и кинетику нуклеации. Обычно кристаллизацию проводят при 4–25 °C. Для некоторых белков необходима строго постоянная температура.

Примеси и добавки

Наличие других белков, фрагментов ДНК, липидов может ингибировать кристаллизацию. Для улучшения качества кристаллов используют добавки: ионы металлов, детергенты, лиганды, кофакторы, низкомолекулярные соединения.

Проблемы и ограничения

Аморфное осаждение

Наиболее частая проблема — выпадение белка в виде неупорядоченного аморфного осадка вместо кристаллов. Причины: слишком быстрое пересыщение, неподходящий осадитель, загрязнения.

Мелкие или дефектные кристаллы

Кристаллы могут быть слишком малы для рентгеновской дифракции (менее 10–20 мкм) или содержать дефекты решётки, ухудшающие качество дифракционной картины. Для увеличения размера применяют посев (seeding) — внесение готовых микроскопических кристаллов в свежий раствор.

Кристаллизация мембранных белков

Мембранные белки, встроенные в липидный бислой, крайне трудно кристаллизовать из-за их гидрофобности и нестабильности вне мембраны. Для них разработаны специальные методы: кристаллизация в липидных кубических фазах (in meso), использование детергентов, амфиполов и нанодисков.

Применение

Рентгеновская кристаллография

Основное применение — определение трёхмерной структуры белка с атомным разрешением. Кристалл облучают рентгеновскими лучами (синхротронное излучение), регистрируют дифракционную картину, по которой с помощью математических методов (преобразование Фурье) восстанавливают электронную плотность и строят модель белка.

Фармацевтика

Кристаллические формы белков используются для разработки лекарственных препаратов. Например, кристаллы инсулина обеспечивают пролонгированное действие. Кристаллизация антител и ферментов позволяет получать стабильные лекарственные формы.

Биотехнология

Кристаллизация применяется для очистки белков, так как кристаллы обычно имеют высокую чистоту. Также используется для создания биосенсоров и биокатализаторов.

Интересные факты

• Самый крупный белковый кристалл, полученный в лаборатории, достигал размеров нескольких миллиметров. Однако для рентгеновской дифракции обычно достаточно кристаллов размером 100–500 мкм.
• Некоторые белки кристаллизуются в природе. Например, кристаллы запасных белков в семенах растений (глобулины, глиадины) или кристаллы гемоцианина в крови моллюсков.
• В 2020 году российские учёные из Института кристаллографии РАН разработали метод кристаллизации белков в условиях микрогравитации на борту Международной космической станции. Кристаллы, выращенные в космосе, часто имеют лучшее качество из-за отсутствия конвекции.

Критика

Кристаллизация белков остаётся «узким местом» структурной биологии. По оценкам, лишь около 10–30 % очищенных белков удаётся закристаллизовать в виде, пригодном для рентгеновской дифракции. Для многих биологически важных белков, особенно мембранных и мультидоменных, кристаллизация до сих пор не решена. Альтернативные методы, такие как криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) и ядерный магнитный резонанс (ЯМР), постепенно вытесняют кристаллографию в некоторых областях, но кристаллизация остаётся незаменимой для получения атомных структур.

Источники

• McPherson A. «Crystallization of Biological Macromolecules». Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.
• Ducruix A., Giegé R. (eds.) «Crystallization of Nucleic Acids and Proteins: A Practical Approach». Oxford University Press, 1999.
• Bergfors T. «Protein Crystallization: Techniques, Strategies, and Tips». International University Line, 1999.
• Chayen N.E., Saridakis E. «Protein Crystallization: From Theory to Practice». Wiley, 2008.
• Обзорные статьи в журналах «Acta Crystallographica Section F», «Journal of Structural Biology», «Crystal Growth & Design».