Синтез на подложке

Синтез на подложке (также известный как синтез на подложке, синтез на твёрдой фазе или синтез на носителе) — это методология химического синтеза, при которой молекулы-мишени (обычно биополимеры, такие как пептиды, олигонуклеотиды или олигосахариды) собираются постадийно на поверхности нерастворимого твёрдого носителя (подложки). Ключевой особенностью является то, что растущая цепь ковалентно прикреплена к подложке, что позволяет проводить реакции, промывки и отделение избытка реагентов простым фильтрованием, без необходимости промежуточной очистки промежуточных продуктов. В конце синтеза целевое соединение отщепляется от носителя.

История

Основы метода были заложены в 1963 году американским биохимиком Робертом Брюсом Меррифилдом, который разработал твёрдофазный синтез пептидов. За это изобретение он был удостоен Нобелевской премии по химии в 1984 году. Изначально метод применялся исключительно для синтеза пептидов на полимерных смолах. В последующие десятилетия технология была адаптирована для синтеза олигонуклеотидов (1970-е годы, работы Х. Г. Корана и М. Каррутерса) и олигосахаридов (1980-е годы). Развитие методов комбинаторной химии в 1990-х годах привело к созданию библиотек соединений на подложках, что ускорило поиск новых лекарственных препаратов.

Принцип метода

Синтез на подложке основан на последовательном присоединении мономеров к растущей цепи, закреплённой на твёрдой фазе. Каждый цикл включает несколько стадий:

1. Связывание первого мономера: Первый мономер (например, аминокислота или нуклеотид) ковалентно прикрепляется к функциональным группам на поверхности подложки через специальный линкер (спейсер).
2. Дезактивация (кэппинг): Блокирование непрореагировавших функциональных групп на подложке, чтобы предотвратить образование ошибочных последовательностей.
3. Удаление защитной группы: Снятие временной защитной группы с растущей цепи, чтобы активировать её для следующего присоединения.
4. Присоединение следующего мономера: Добавление следующего мономера, активированного для реакции.
5. Промывка: Удаление избытка реагентов и побочных продуктов фильтрованием.
6. Повторение цикла: Циклы повторяются до получения последовательности требуемой длины.
7. Отщепление: Готовое соединение отщепляется от подложки с помощью химического реагента (например, кислоты или основания), часто одновременно с удалением постоянных защитных групп.

Типы подложек

Выбор подложки критически важен для эффективности синтеза. Основные требования: химическая инертность к условиям реакции, набухаемость в растворителях, наличие функциональных групп для закрепления первого мономера и механическая стабильность.

Полимерные смолы

Наиболее распространённый тип подложек. Представляют собой сшитые полимерные гранулы (шарики) диаметром от 50 до 200 мкм.

• Смолы на основе полистирола: Сшитые дивинилбензолом. Используются в синтезе пептидов и олигонуклеотидов. Примеры: смола Меррифилда, смола Ванга.
• Смолы на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ): Обладают лучшей набухаемостью в полярных растворителях и меньшей склонностью к неспецифической сорбции. Примеры: TentaGel, ChemMatrix.
• Смолы на основе полиакриламида: Используются для синтеза в водных средах.

Стеклянные и кремниевые подложки

Используются в основном для синтеза олигонуклеотидов на микрочипах (биочипах). Представляют собой плоские пластины или пористые стеклянные диски с нанесёнными на них функциональными группами (например, амино- или эпоксигруппами). Позволяют проводить параллельный синтез тысяч различных последовательностей на одном чипе.

Другие типы

• Целлюлозные мембраны: Используются для синтеза пептидных массивов (SPOT-синтез).
• Магнитные частицы: Позволяют проводить автоматизированные процедуры с использованием магнитной сепарации.

Применение

Синтез пептидов

Твёрдофазный синтез пептидов (SPPS) — наиболее зрелое и широко распространённое применение метода. Позволяет получать пептиды длиной до 50-100 аминокислотных остатков с высокой чистотой и выходом. Используется для создания лекарственных препаратов (например, аналогов соматостатина, инсулина), а также для исследования структуры и функции белков.

Синтез олигонуклеотидов

Твёрдофазный синтез олигонуклеотидов является стандартным методом получения коротких фрагментов ДНК и РНК (праймеров, зондов, аптамеров). Используется в ПЦР, секвенировании, генной инженерии и диагностике. Автоматизированные синтезаторы позволяют получать олигонуклеотиды длиной до 100-200 нуклеотидов.

Синтез олигосахаридов

Твёрдофазный синтез олигосахаридов менее развит, чем синтез пептидов и нуклеотидов, из-за сложности стереохимического контроля. Однако метод активно развивается для создания сложных углеводных структур, вакцин и гликомиметиков.

Комбинаторная химия

Синтез на подложке является основой комбинаторной химии — метода создания больших библиотек (сотен тысяч и миллионов) родственных соединений. Каждая гранула смолы может содержать уникальное соединение, что позволяет проводить высокопроизводительный скрининг биологической активности.

Синтез небиологических полимеров

Метод применяется для синтеза олигомеров с заданной последовательностью, таких как пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК), полиамиды и полиэфиры.

Преимущества и недостатки

Преимущества

• Простота очистки: Промежуточные продукты не требуют очистки, так как все избытки реагентов и побочные продукты удаляются промывкой.
• Автоматизация: Процесс легко поддаётся автоматизации, что позволяет создавать высокопроизводительные синтезаторы.
• Высокая скорость: Возможность использования большого избытка реагентов для ускорения реакций.
• Возможность параллельного синтеза: На одной подложке можно синтезировать несколько различных соединений (например, на микрочипах).

Недостатки

• Ограничения по длине цепи: С увеличением длины цепи снижается выход и чистота продукта из-за накопления ошибок и побочных реакций.
• Необходимость в защитных группах: Требуется использование временных защитных групп, что усложняет синтез и может приводить к побочным реакциям.
• Сложность анализа: Трудно контролировать ход реакции на поверхности подложки в реальном времени.
• Ограничения по растворимости: Некоторые реагенты и промежуточные продукты могут плохо растворяться в используемых растворителях.

Интересные факты

• Первый автоматический синтезатор пептидов был создан самим Робертом Меррифилдом в 1965 году. Он представлял собой механическое устройство, управляемое кулачковым механизмом.
• Метод синтеза на подложке используется не только в химии, но и в биологии, например, для синтеза пептидных массивов, используемых для изучения взаимодействий антител и белков.
• Современные синтезаторы олигонуклеотидов способны синтезировать до 96 различных последовательностей одновременно в 96-луночных планшетах.

Источники

• Меррифилд, Р. Б. (1963). Твёрдофазный синтез пептидов. Журнал Американского химического общества, 85(14), 2149-2154.
• Каррутерс, М. Х. (1985). Синтез олигонуклеотидов на твёрдой фазе. Science, 230(4723), 281-285.
• Стьюарт, Дж. М., & Янг, Дж. Д. (1984). Твёрдофазный синтез пептидов. Пирс Компани.
• Галоп, Н., & Итц, Л. (2001). Твёрдофазный синтез олигосахаридов. Химические обзоры, 101(11), 3309-3342.
• Лэм, К. С., & Салмон, С. Е. (1991). Комбинаторная химия на твёрдой фазе. Nature, 354(6350), 82-84.