Тест Эймса

Тест Эймса — это биологический метод оценки мутагенной активности химических соединений, основанный на использовании специально выведенных штаммов бактерии Salmonella typhimurium. Тест позволяет выявить способность вещества вызывать точечные мутации — замены или сдвиги рамки считывания в ДНК. Разработан в 1970-х годах американским биохимиком Брюсом Эймсом и его коллегами и остаётся одним из наиболее распространённых скрининговых тестов для первичной оценки генотоксичности и потенциальной канцерогенности химикатов.

История создания

К началу 1970-х годов накопилось множество данных о связи между мутагенностью и канцерогенностью химических соединений. Однако существовавшие методы тестирования на животных (например, на мышах и крысах) были дорогими, длительными (до двух лет) и требовали больших количеств исследуемого вещества. Брюс Эймс, работавший в Калифорнийском университете в Беркли, предложил простую, быструю и дешёвую бактериальную систему взамен.

В 1971 году вышла первая публикация Эймса с описанием метода, а в 1973 году — статья, в которой он и его коллеги представили усовершенствованную версию теста с использованием штаммов Salmonella typhimurium, несущих мутации в гене гистидинового оперона. К 1975 году тест был стандартизирован и начал широко применяться в токсикологии, фармакологии и экологическом мониторинге.

Принцип метода

Тест основан на способности мутагенных веществ вызывать обратные мутации (реверсии) у бактерий, которые не могут синтезировать гистидин — аминокислоту, необходимую для их роста. Исходные штаммы-тестеры являются ауксотрофами по гистидину: они растут только на питательной среде, содержащей гистидин. Если исследуемое соединение вызывает мутацию, восстанавливающую функцию гена, бактерия вновь приобретает способность синтезировать гистидин (прототрофность) и образует колонию на минимальной среде без гистидина.

Количество выросших колоний (ревертантов) прямо пропорционально мутагенной активности вещества. Для контроля используется спонтанный уровень реверсий (без добавления тестируемого соединения).

Штаммы-тестеры

Для теста Эймса применяются специально сконструированные штаммы Salmonella typhimurium с различными типами мутаций в гистидиновом опероне. Каждый штамм чувствителен к определённому типу мутаций:

• TA98 — выявляет мутации сдвига рамки считывания (frameshift mutations).
• TA100 — выявляет замены оснований (base-pair substitutions) — преимущественно GC→TA трансверсии.
• TA1535 — также чувствителен к заменам оснований, но менее чувствителен, чем TA100.
• TA1537 и TA1538 — выявляют сдвиги рамки считывания, особенно в участках с повторами GC-пар.

Кроме того, все штаммы несут дополнительные мутации, повышающие чувствительность теста:

• Делеция гена uvrB — нарушает репарацию ДНК, что делает бактерии более восприимчивыми к мутациям.
• Мутация в гене rfa — делает клеточную стенку более проницаемой для крупных молекул.
• Плазмида pKM101 (у штаммов TA98 и TA100) — усиливает SOS-ответ и увеличивает частоту мутаций.

Метаболическая активация

Многие химические соединения (проканцерогены) не проявляют мутагенной активности сами по себе, но становятся мутагенными после метаболической активации в организме. Для имитации этого процесса в тест Эймса добавляют фракцию микросом печени млекопитающих (обычно крыс), обработанных индукторами ферментов (например, полихлорированными бифенилами или фенобарбиталом). Эта фракция, обозначаемая как S9, содержит цитохром P450-зависимые монооксигеназы, которые превращают проканцерогены в активные мутагены.

Тест проводят в двух вариантах:

• Без активации (без S9) — для прямых мутагенов.
• С активацией (с S9) — для проканцерогенов.

Процедура проведения

Стандартный протокол теста Эймса включает несколько этапов:

1. Приготовление бактериальной культуры — ночная культура штамма-тестера в питательном бульоне.
2. Приготовление исследуемого вещества — растворение в подходящем растворителе (диметилсульфоксид, этанол, вода). Готовят несколько концентраций, обычно в диапазоне от 0,1 до 5000 мкг на чашку.
3. Приготовление S9-смеси — при необходимости.
4. Внесение компонентов — в пробирку с расплавленным агаром (0,6% агар, 0,5% NaCl, 0,05 мМ биотина, 0,05 мМ гистидина) вносят бактериальную культуру, исследуемое вещество и S9-смесь (если требуется). Смесь выливают на чашку Петри с минимальной агаровой средой.
5. Инкубация — чашки инкубируют при 37°C в течение 48–72 часов.
6. Подсчёт колоний — подсчитывают количество ревертантных колоний на каждой чашке. Результаты сравнивают с отрицательным контролем (растворитель без вещества) и положительным контролем (известный мутаген, например, 2-аминоантрацен или натрия азид).

Оценка результатов

Результат теста считается положительным, если количество ревертантов в опытных чашках превышает спонтанный уровень в два и более раза и наблюдается дозозависимый эффект (увеличение числа колоний с ростом концентрации вещества). Для статистической обработки часто используют критерий Даннета или регрессионный анализ.

Отрицательный результат не означает абсолютную безопасность вещества, так как тест не выявляет:

• Мутации, не затрагивающие гистидиновый оперон.
• Хромосомные аберрации (разрывы, делеции, транслокации).
• Анеугенные эффекты (нарушение расхождения хромосом).
• Эпигенетические механизмы канцерогенеза.

Применение

Тест Эймса широко используется в различных областях:

• Скрининг новых химических соединений — в фармацевтической, косметической, пищевой и химической промышленности для оценки потенциальной мутагенности до начала клинических испытаний.
• Экологический мониторинг — анализ проб воды, почвы, воздуха, пищевых продуктов на наличие мутагенов. Например, тест применялся для выявления мутагенов в выхлопных газах автомобилей, табачном дыме, жареном мясе.
• Исследование механизмов мутагенеза — изучение зависимости структура-активность мутагенов.
• Тестирование лекарственных средств — входит в обязательный набор доклинических исследований по регламентирующим документам (например, ICH S2(R1) — Руководство по генотоксичности).

Преимущества и ограничения

Преимущества

• Высокая скорость и низкая стоимость (по сравнению с тестами на млекопитающих).
• Высокая чувствительность — позволяет выявить мутагены в концентрациях до нанограммов на чашку.
• Хорошая корреляция с канцерогенностью: по разным оценкам, от 80 до 90% канцерогенов, выявленных в опытах на животных, дают положительный результат в тесте Эймса.
• Простота выполнения и воспроизводимость.

Ограничения

• Не все канцерогены являются мутагенами (например, асбест, диэтилстильбэстрол, некоторые гормоны).
• Тест не выявляет вещества, действующие через механизмы, не связанные с повреждением ДНК (например, промоторы опухолей).
• Бактериальная система не полностью моделирует метаболизм млекопитающих — некоторые мутагены могут активироваться или инактивироваться иначе.
• Ложноотрицательные результаты возможны для соединений, которые требуют специфической активации, не воспроизводимой S9-фракцией.
• Ложноположительные результаты могут давать вещества, вызывающие окислительный стресс или токсичные для бактерий (например, некоторые антибиотики).

Модификации теста

Для повышения информативности и расширения спектра выявляемых мутаций разработаны различные модификации:

• Микросуспензионный тест Эймса — использует концентрированную бактериальную суспензию для увеличения чувствительности.
• Тест с использованием штаммов, чувствительных к окислительному стрессу (например, штаммы с делецией гена katG).
• Флуоресцентные варианты — подсчёт ревертантов с помощью автоматизированных систем.
• Тест Эймса в жидкой среде — для анализа летучих соединений.
• Комбинированные подходы — совместное использование с тестом на хромосомные аберрации (например, тест на микроядра) или с тестом на индукцию SOS-ответа (SOS-хромотест).

Источники

1. Ames B.N., Durston W.E., Yamasaki E., Lee F.D. (1973). Carcinogens are mutagens: a simple test system combining liver homogenates for activation and bacteria for detection. Proceedings of the National Academy of Sciences, 70(8), 2281–2285.
2. Ames B.N., McCann J., Yamasaki E. (1975). Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test. Mutation Research, 31(6), 347–364.
3. Maron D.M., Ames B.N. (1983). Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research, 113(3–4), 173–215.
4. Mortelmans K., Zeiger E. (2000). The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay. Mutation Research, 455(1–2), 29–60.
5. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. Р.У. Хабриева. — М.: Медицина, 2005.
6. OECD Guideline for Testing of Chemicals, No. 471: Bacterial Reverse Mutation Test (2020).