Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens — это грамотрицательная палочковидная бактерия из семейства Rhizobiaceae, являющаяся возбудителем заболевания корончатого галла (бактериального рака корней) у двудольных растений. Относится к классу Alphaproteobacteria. В природе бактерия обитает в почве, проникая в растения через раны на корнях или стеблях. Основной отличительной особенностью A. tumefaciens является способность к горизонтальному переносу генов в растительный геном, что делает её уникальным инструментом в генной инженерии.

История открытия

Заболевание корончатый галл было известно с древних времён, однако его бактериальная природа была установлена в начале XX века. В 1907 году американские учёные Эрвин Фрэнк Смит и К. О. Таунсенд впервые выделили бактерию из опухолей растений и доказали, что именно она вызывает образование галлов. В 1911 году микроорганизм получил название Bacterium tumefaciens.

Долгое время механизм патогенеза оставался загадкой. В 1947 году американский микробиолог Армин Браун показал, что бактерия способна трансформировать нормальные растительные клетки в опухолевые, причём сами бактерии для поддержания роста опухоли не требуются. Это указывало на передачу какого-то стабильного фактора, предположительно ДНК.

Ключевое открытие было сделано в 1970-х годах. В 1974 году группа учёных под руководством Жана Шеля и Марка ван Монтегю (Бельгия) и независимо от них Роберт Фрайли (США) обнаружили, что A. tumefaciens содержит большую плазмиду (кольцевую молекулу ДНК), названную Ti-плазмидой (Tumor-inducing). Именно эта плазмида отвечает за вирулентность. В 1977 году исследователи доказали, что часть Ti-плазмиды (T-ДНК) встраивается в ядерный геном растения. За это открытие Жан Шель и Марк ван Монтегю были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1984 году (совместно с другими исследователями).

Таксономия и классификация

Agrobacterium tumefaciens относится к семейству Rhizobiaceae, в которое также входят азотфиксирующие симбионты рода Rhizobium. Внутри рода Agrobacterium существует несколько видов, вызывающих сходные заболевания:

Agrobacterium tumefaciens — возбудитель корончатого галла (опухоли на корнях и стеблях).
Agrobacterium rhizogenes — вызывает «бородатые» корни (hairy root disease), при котором образуются множественные корнеподобные выросты.
Agrobacterium vitis — поражает виноград, вызывая галлы на лозе.
Agrobacterium rubi — поражает малину и ежевику.

Современная молекулярная филогенетика (на основе анализа 16S рРНК) показывает, что все виды Agrobacterium тесно связаны и часто объединяются в один вид — Agrobacterium tumefaciens sensu lato, но традиционно сохраняется разделение по патогенетическим признакам.

Морфология и физиология

Agrobacterium tumefaciens представляет собой прямые или слегка изогнутые палочки размером 0,6–1,0 × 1,5–3,0 мкм. Бактерии подвижны благодаря наличию 1–4 жгутиков, расположенных перитрихиально (по всей поверхности). Спор не образуют. Грамотрицательны, что означает наличие двух мембран (цитоплазматической и внешней) и тонкого слоя пептидогликана.

Являются хемоорганотрофами, то есть получают энергию за счёт окисления органических соединений. Оптимальная температура роста — 25–28 °C, pH — 6,0–7,0. Аэробны, но могут расти в микроаэрофильных условиях. На твёрдых питательных средах (например, LB-агаре) образуют гладкие, выпуклые, слизистые колонии белого или кремового цвета.

Механизм патогенеза и Ti-плазмида

Патогенность A. tumefaciens полностью определяется наличием Ti-плазмиды — внехромосомной кольцевой ДНК размером около 200–250 тысяч пар оснований. Ti-плазмида содержит несколько ключевых функциональных участков:

T-ДНК (Transfer DNA)

Это участок Ti-плазмиды, который переносится в растительную клетку и встраивается в её ядерный геном. T-ДНК ограничена двумя 25-нуклеотидными повторами — левой (LB) и правой (RB) границами. В природной T-ДНК находятся гены, кодирующие ферменты синтеза ауксинов (iaaM, iaaH) и цитокининов (ipt), а также гены синтеза опинов (например, nopaline, octopine). Ауксины и цитокинины вызывают неконтролируемое деление растительных клеток, формируя опухоль. Опины — это специфические аминокислотные производные, которые бактерия использует как источник углерода и азота, но не могут использовать другие микроорганизмы.

Гены вирулентности (vir-гены)

Расположены на Ti-плазмиде вне T-ДНК, но необходимы для её переноса. Система vir состоит из примерно 10 оперонов (virA, virB, virC, virD, virE, virG и др.). Эти гены кодируют белки, которые:

Распознают растительные сигналы (фенольные соединения, например, ацетосирингон, выделяемые из ран).
Обеспечивают образование пили IV типа (T4SS — система секреции IV типа), через которую T-ДНК переносится в растительную клетку.
Обрабатывают T-ДНК, вырезая её из плазмиды и формируя одноцепочечную молекулу (T-цепь).
Транспортируют T-цепь вместе с белками VirE2 и VirD2 в ядро растительной клетки.

Процесс заражения

Прикрепление: Бактерия прикрепляется к клеткам растения в месте ранения.
Активация vir-генов: Растительные фенольные соединения (ацетосирингон) активируют двухкомпонентную систему VirA/VirG, которая запускает транскрипцию остальных vir-генов.
Перенос T-ДНК: Белки VirD1/VirD2 разрезают T-ДНК по границам, и одноцепочечная T-цепь транспортируется в растительную клетку через T4SS-пиль.
Интеграция: T-цепь, покрытая белками VirE2 и VirD2, проникает в ядро и встраивается в растительную хромосому с помощью клеточных механизмов репарации ДНК.
Экспрессия: Встроенные гены начинают экспрессироваться, вызывая синтез ауксинов, цитокининов и опинов. Растительные клетки трансформируются в опухолевые, а бактерия получает источник питания.

Применение в генной инженерии

Способность A. tumefaciens переносить ДНК в растения сделала её незаменимым инструментом для создания генетически модифицированных (трансгенных) растений. Метод, основанный на использовании Ti-плазмиды, называется Agrobacterium-опосредованной трансформацией.

Принцип метода

В лабораторных условиях природную Ti-плазмиду модифицируют:

Удаляют гены, вызывающие опухоли (гены синтеза ауксинов и цитокининов), чтобы трансформированные клетки не образовывали галлы.
Вставляют в T-ДНК целевой ген (например, ген устойчивости к гербицидам, ген инсектицидного токсина Bt или ген, улучшающий питательные свойства) и селективный маркер (например, ген устойчивости к антибиотику канамицину).
Полученную рекомбинантную Ti-плазмиду вводят в A. tumefaciens.
Бактерией инфицируют фрагменты растительной ткани (экспланты) в стерильных условиях.
Трансформированные растительные клетки отбирают на селективной среде, содержащей антибиотик.
Из отобранных клеток регенерируют целые растения.

Преимущества метода

Высокая эффективность и точность встраивания T-ДНК.
Возможность переноса крупных фрагментов ДНК (до 150–200 тысяч пар оснований).
Интеграция в ядерный геном, что обеспечивает стабильное наследование признака.

Ограничения

Естественная восприимчивость A. tumefaciens ограничена в основном двудольными растениями. Для однодольных (злаков, включая пшеницу, кукурузу, рис) требуются специальные штаммы или дополнительные обработки (например, ацетосирингоном).
Необходимость использования селективных маркеров (часто антибиотиков), что вызывает опасения у некоторых потребителей.

Примеры трансгенных растений, созданных с помощью A. tumefaciens

Устойчивые к гербицидам: соя, кукуруза, рапс (Roundup Ready).
Устойчивые к насекомым: хлопчатник, кукуруза (Bt-культуры).
С улучшенным составом: «золотой рис» с повышенным содержанием бета-каротина.
Устойчивые к вирусам: папайя, кабачки.

Экологическое значение и распространение

Agrobacterium tumefaciens широко распространена в почвах умеренного и тропического климата. В природе она вызывает заболевание корончатый галл у многих плодовых, декоративных и лесных культур (яблоня, груша, вишня, роза, виноград, подсолнечник, табак). Экономический ущерб от болезни может быть значительным, особенно в питомниках и садах, где галлы нарушают сосудистую систему растений, снижая урожайность и приводя к гибели.

Бактерия может сохраняться в почве в течение нескольких лет, а также в растительных остатках. Передача происходит через почву, воду, инструменты (садовые ножи, секаторы) и корневые выделения. Борьба с заболеванием включает использование здорового посадочного материала, дезинфекцию инструментов, севооборот и применение биологических препаратов (например, непатогенных штаммов Agrobacterium radiobacter).

Интересные факты

Agrobacterium tumefaciens — единственный известный природный организм, способный к межцарственному переносу генов (от прокариот к эукариотам).
Механизм переноса T-ДНК через T4SS-пиль напоминает конъюгацию (перенос плазмид между бактериями), что указывает на эволюционное происхождение системы от бактериального конъюгативного аппарата.
В 2019 году учёные из Университета Миннесоты показали, что A. tumefaciens может переносить T-ДНК не только в растения, но и в клетки человека (в культуре), хотя в естественных условиях это не происходит.
Название «Agrobacterium» происходит от греческих слов «agros» (поле) и «bacterion» (палочка), а «tumefaciens» — от латинского «tumefacere» (делать опухшим).

Источники

Smith, E. F., & Townsend, C. O. (1907). A plant-tumor of bacterial origin. Science, 25(643), 671-673.
Chilton, M. D., Drummond, M. H., Merlo, D. J., Sciaky, D., Montoya, A. L., Gordon, M. P., & Nester, E. W. (1977). Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: the molecular basis of crown gall tumorigenesis. Cell, 11(2), 263-271.
Gelvin, S. B. (2003). Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the “gene-jockeying” tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67(1), 16-37.
Zupan, J., Muth, T. R., Draper, O., & Zambryski, P. (2000). The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights. The Plant Journal, 23(1), 11-28.
Nester, E. W. (2015). Agrobacterium: nature’s genetic engineer. Frontiers in Plant Science, 5, 730.
Биотехнология растений: методы и достижения / под ред. М. В. Гусева. — М.: Наука, 2018. — 320 с.

BFOmetr — база данных и аналитика по компаниям России.

На главную BFOmetr →