Бескаркасная биопечать

Бескаркасная биопечать — это технология аддитивного производства трёхмерных живых тканей и органов, при которой клетки и биоматериалы наносятся послойно без использования предварительно изготовленного твёрдого каркаса (скаффолда). В отличие от классической скаффолд-зависимой биопечати, где клетки заселяются на искусственный пористый матрикс, бескаркасный подход предполагает формирование тканевой структуры непосредственно в процессе печати, часто с использованием клеточных сфероидов, тканевых нитей или гидрогелей, которые сами выполняют роль временной опоры.

История развития

Предпосылки возникновения

Традиционная тканевая инженерия, возникшая в 1980-х годах, основывалась на создании биосовместимых каркасов из синтетических или природных полимеров. Однако к началу 2000-х годов стали очевидны ограничения этого подхода: сложность точного воспроизведения микроархитектуры нативного внеклеточного матрикса, риск иммунного отторжения, а также трудности с васкуляризацией толстых тканей. Это стимулировало поиск методов, позволяющих клеткам самостоятельно организовываться в ткани.

Первые экспериментальные работы

В 2003 году группа под руководством Томаса Боланда (США) впервые продемонстрировала возможность струйной печати живых клеток на гидрогелевую подложку. Однако настоящим прорывом стала работа японского учёного Кодзи Накамуры, который в 2005 году предложил концепцию «биопечати без каркаса» с использованием клеточных сфероидов. В 2009 году исследователи из Университета Уэйк Форест (США) напечатали первый бескаркасный кровеносный сосуд, используя сфероиды из гладкомышечных клеток.

Современный этап

С 2015 года технология активно развивается в нескольких направлениях. В 2019 году российские учёные из компании «3D Bioprinting Solutions» (резидент «Сколково») впервые в мире напечатали щитовидную железу мыши без использования каркаса, которая после трансплантации начала функционировать. В 2022 году группа из Тель-Авивского университета создала бескаркасный фрагмент сердечной ткани с собственной сетью капилляров. К 2024 году бескаркасная биопечать остаётся преимущественно экспериментальной технологией, но уже применяется для создания моделей для тестирования лекарств.

Принципы и методы

Формирование строительных блоков

Ключевое отличие бескаркасного подхода — использование клеточных агрегатов в качестве «строительных кирпичиков». Основные типы блоков:

• Клеточные сфероиды — сферические скопления клеток диаметром 100–500 мкм, которые образуются в условиях низкой адгезии к подложке. Сфероиды обладают собственной внеклеточной матрицей и способны к слиянию (фузии).
• Тканевые нити — цилиндрические структуры, получаемые путём культивирования клеток в микрожелобках. Используются для печати трубчатых органов (сосудов, мочеточников).
• Клеточные гранулы — фрагменты тканей, полученные ферментативной обработкой или механическим измельчением.

Технологии печати

1. Экструзионная биопечать сфероидов: сфероиды подаются через сопло под давлением. Для предотвращения повреждения клеток используется низкое давление (0,1–0,5 атм) и специальные суспензионные среды (например, раствор гиалуроновой кислоты).
2. Лазерная стереолитография: лазерный луч формирует трёхмерную структуру, полимеризуя гидрогель, содержащий клетки. Позволяет достичь разрешения до 10 мкм.
3. Биопечать на основе свободной плавучей среды: клетки или сфероиды помещаются в ванну с гелем-подложкой (например, из желатина или альгината), который обеспечивает поддержку структуры во время печати, а затем удаляется.

Процесс слияния (фузия)

После печати сфероиды или нити помещаются в инкубатор (37°C, 5% CO₂), где в течение 24–72 часов происходит их самосборка. Клетки мигрируют, секретируют внеклеточный матрикс и формируют непрерывную ткань. Этот процесс напоминает эмбриональное развитие тканей.

Классификация

По типу конечного продукта

• Простые тканевые конструкции (толщиной до 200 мкм) — кожа, роговица, участки слизистой. Не требуют сложной васкуляризации.
• Трубчатые органы — кровеносные сосуды, трахея, мочеточники. Печатаются в виде многослойных трубок из сфероидов разных типов клеток.
• Паренхиматозные органы — печень, почка, поджелудочная железа. Наиболее сложные объекты, требующие интеграции сосудистой сети и желчных/мочевых протоков.

По используемому материалу

• Чисто клеточные конструкции — только клетки без дополнительных материалов. Используются для тонких тканей.
• Гибридные конструкции — клетки в сочетании с гидрогелями (коллаген, фибрин, альгинат) или децеллюляризированным матриксом. Гидрогели выполняют роль временного клея или среды для поддержки формы.

Применение

Медицинские исследования

• Моделирование заболеваний — создание бескаркасных опухолевых моделей для тестирования химиотерапевтических препаратов. Например, в 2023 году в Институте стволовых клеток человека (Москва) напечатали модель глиобластомы для оценки проницаемости лекарств.
• Токсикология — печень, напечатанная без каркаса, используется для анализа метаболизма новых лекарственных соединений. Такие модели более физиологичны, чем 2D-культуры клеток.

Трансплантология

• Кожные трансплантаты — бескаркасные лоскуты кожи уже проходят клинические испытания в Китае (2023) для лечения ожогов. Они лучше приживаются, чем традиционные кожные эквиваленты на коллагеновой основе.
• Кровеносные сосуды — в 2021 году в США проведена первая успешная имплантация бескаркасного сосуда диаметром 4 мм в бедренную артерию овцы. Сосуд сохранял проходимость 6 месяцев.
• Щитовидная железа — экспериментальные трансплантации мышам показали, что напечатанная железа начинает вырабатывать тироксин через 2 недели после имплантации.

Фармацевтика

• Персонализированное тестирование — бескаркасные ткани из клеток конкретного пациента позволяют подбирать индивидуальную терапию (например, при химиотерапии рака).
• Скрининг препаратов — компания Organovo (США) с 2014 года продаёт бескаркасные модели печени для фармацевтических компаний. Стоимость одной модели — около 500 долларов.

Преимущества и ограничения

Преимущества

• Биомиметичность — отсутствие искусственного каркаса позволяет клеткам формировать собственный внеклеточный матрикс, более близкий к нативному.
• Снижение иммунного ответа — нет синтетических материалов, которые могут вызывать воспаление.
• Возможность ремоделирования — напечатанная ткань может расти и перестраиваться вместе с организмом реципиента, что критично для детской трансплантологии.
• Высокая клеточная плотность — в бескаркасных конструкциях плотность клеток достигает 10⁸ клеток/см³, что соответствует плотности нативных тканей.

Ограничения

• Сложность масштабирования — для печати органов размером более 1 см³ необходимо решить проблему васкуляризации. Без кровеносных сосудов клетки в центре конструкции погибают от гипоксии в течение 48 часов.
• Механическая прочность — бескаркасные ткани менее прочны, чем скаффолд-зависимые конструкции. Они легко деформируются при манипуляциях.
• Стандартизация — сфероиды разного размера и формы трудно воспроизводить с высокой точностью, что влияет на качество печати.
• Стоимость — производство одного сфероида стоит около 0,1–0,5 доллара, для печати почки человека потребуется порядка 10⁶ сфероидов, что делает технологию экономически невыгодной на текущем этапе.

Исследования в России

Российские учёные занимают заметную позицию в области бескаркасной биопечати. В 2018 году на Международной космической станции (МКС) был проведён эксперимент «Биопринтер» — печать бескаркасных тканевых конструкций в условиях микрогравитации. Оказалось, что в невесомости сфероиды сливаются быстрее и формируют более однородные структуры, чем на Земле. В 2020 году компания «3D Bioprinting Solutions» совместно с Курчатовским институтом напечатала бескаркасный фрагмент щитовидной железы человека, который был успешно трансплантирован мыши с искусственно вызванным гипотиреозом. В 2023 году в Первом Московском государственном медицинском университете имени И.М. Сеченова начались доклинические испытания бескаркасных кожных трансплантатов для лечения диабетических язв.

Этические и правовые аспекты

Основные этические вопросы связаны с источником клеток. Для бескаркасной биопечати чаще всего используются индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), полученные из клеток крови или кожи пациента. Это снимает этические проблемы, связанные с эмбриональными стволовыми клетками. Однако остаются вопросы регулирования: в России и большинстве стран мира бескаркасные ткани пока не классифицируются как лекарственные средства или медицинские изделия, что затрудняет их клиническое внедрение. В 2022 году Минздрав РФ инициировал разработку ГОСТа для биопечатных тканей, который должен быть принят к 2025 году.

Перспективы

Основные направления развития бескаркасной биопечати:

• Интеграция с микрофлюидикой — создание «органов-на-чипе» с бескаркасными тканями для моделирования физиологических процессов.
• 4D-биопечать — использование материалов, меняющих форму под воздействием температуры или pH, что позволит создавать самоорганизующиеся ткани.
• Биопечать in situ — прямое нанесение клеток на повреждённый орган пациента во время операции. В 2024 году группа из Университета Торонто (Канада) впервые напечатала бескаркасный фрагмент хряща непосредственно в дефект коленного сустава кролика.
• Комбинирование с нанотехнологиями — добавление в сфероиды наночастиц с факторами роста для ускорения васкуляризации.

Источники

• Murphy S.V., Atala A. «3D bioprinting of tissues and organs». Nature Biotechnology, 2014.
• Ozbolat I.T. «Scaffold-Based or Scaffold-Free Bioprinting: Competing or Complementing Approaches?» Journal of Nanotechnology in Engineering and Medicine, 2015.
• Mironov V. et al. «Organ printing: tissue spheroids as building blocks». Biomaterials, 2009.
• Отчёт о результатах эксперимента «Биопринтер» на МКС. РКК «Энергия», 2019.
• «3D Bioprinting Solutions: Technology Overview». Skolkovo Innovation Center, 2022.
• ГОСТ Р 58000-2022 «Биопринтинг. Термины и определения». Росстандарт, 2022.