Буфер Триса¶

Буфер Триса — это химический буферный раствор, широко используемый в биохимии и молекулярной биологии для поддержания стабильного значения pH в диапазоне от 7,0 до 9,0. Основным действующим компонентом является трис(гидроксиметил)аминометан (C₄H₁₁NO₃), также известный под названиями Трис, ТРИС, трис-буфер или THAM. Буфер Триса отличается низкой токсичностью, высокой растворимостью в воде и способностью эффективно противостоять изменениям pH при добавлении кислот или оснований, что делает его незаменимым в лабораторных исследованиях, особенно при работе с нуклеиновыми кислотами и белками.

¶История

Трис(гидроксиметил)аминометан был впервые синтезирован в 1940-х годах шведским химиком Хансом фон Эйлером-Хельпином, однако его применение в качестве буфера получило широкое распространение в 1960-х годах. В 1966 году американский биохимик Норман Гуд разработал серию буферов для биологических исследований, включая Трис, который стал одним из наиболее популярных благодаря своей доступности и стабильности. С тех пор буфер Триса используется в тысячах лабораторных протоколов, включая электрофорез, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и очистку белков.

¶Химические свойства

Буфер Триса представляет собой слабое основание с константой диссоциации (pKa) около 8,07 при 25 °C. Это значение pKa делает его эффективным буфером в щелочной области, где он способен нейтрализовать добавляемые кислоты. При изменении температуры pKa Триса изменяется примерно на –0,028 единиц pH на градус Цельсия, что требует учёта при проведении экспериментов при разных температурах. Раствор Триса обычно готовят в виде солянокислой соли (Трис-HCl), которая легко растворяется в воде и образует прозрачный раствор.

¶Реакция диссоциации

В водном растворе Трис реагирует с кислотой (например, HCl) с образованием протонированной формы: \[ \text{(HOCH}_2\text{)}_3\text{CNH}_2 + \text{HCl} \rightleftharpoons \text{(HOCH}_2\text{)}_3\text{CNH}_3^+ + \text{Cl}^- \] Эта реакция обратима, и при добавлении основания равновесие смещается в сторону исходного основания, что позволяет поддерживать pH в заданном диапазоне.

¶Приготовление

Стандартный буфер Триса готовят растворением трис(гидроксиметил)аминометана в дистиллированной воде с последующим доведением pH до нужного значения с помощью соляной кислоты (HCl) или гидроксида натрия (NaOH). Концентрация обычно варьируется от 10 мМ до 1 М, в зависимости от требуемой буферной ёмкости. Для точного контроля pH рекомендуется использовать pH-метр, так как визуальные индикаторы могут давать погрешность.

¶Пример приготовления 1 М раствора Трис-HCl (pH 8,0)

1. Растворить 121,14 г трис(гидроксиметил)аминометана (молекулярная масса 121,14 г/моль) в 800 мл дистиллированной воды.
2. Добавить около 60 мл 1 М HCl, постоянно перемешивая, и довести pH до 8,0 с помощью pH-метра.
3. Довести объём до 1 л дистиллированной водой.
4. Простерилизовать автоклавированием или фильтрацией через мембранный фильтр (0,22 мкм).

¶Применение

Буфер Триса используется в различных областях биологии и химии, где требуется стабильный pH в щелочной среде. Основные области применения включают:

¶Электрофорез нуклеиновых кислот

В агарозном и полиакриламидном гель-электрофорезе буфер Триса (часто в комбинации с борной кислотой и ЭДТА, образуя TBE-буфер, или с ацетатом и ЭДТА, образуя TAE-буфер) служит для поддержания pH во время разделения фрагментов ДНК или РНК. Например, TBE-буфер (трис-борат-ЭДТА) используется для разделения небольших фрагментов, а TAE-буфер (трис-ацетат-ЭДТА) — для более крупных.

¶Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

В реакциях ПЦР буфер Триса обеспечивает оптимальный pH для работы ДНК-полимеразы (например, Taq-полимеразы), которая наиболее активна при pH 8,0–9,0. Типичный ПЦР-буфер содержит 10–50 мМ Трис-HCl, а также ионы магния и калия.

¶Очистка белков

При хроматографической очистке белков буфер Триса используется для элюции и стабилизации белков, особенно в ионообменной хроматографии, где pH влияет на заряд белковых молекул. Например, при анионообменной хроматографии белки связываются с колонкой при pH 8,0 и элюируются градиентом соли.

¶Иммунологические методы

В иммуноферментном анализе (ELISA) и вестерн-блоттинге буфер Триса применяется в качестве промывочного и блокирующего буфера. Например, TBST (трис-буферный солевой раствор с Твином-20) используется для снижения неспецифического связывания антител.

¶Медицина и фармакология

Трис(гидроксиметил)аминометан (THAM) используется в клинической медицине как буфер для коррекции метаболического ацидоза, особенно при почечной недостаточности или при лечении отравлений салицилатами. Внутривенное введение THAM позволяет снижать кислотность крови без риска гипернатриемии, связанного с бикарбонатом натрия.

¶Преимущества и недостатки

¶Преимущества

• Широкий диапазон буферной ёмкости (pH 7,0–9,0).
• Низкая токсичность для клеток и организмов.
• Хорошая растворимость в воде и совместимость с большинством лабораторных реагентов.
• Доступность и низкая стоимость.

¶Недостатки

• Чувствительность к температуре: pKa изменяется с температурой, что может влиять на точность pH в термостатируемых экспериментах.
• Способность образовывать комплексы с некоторыми ионами металлов, такими как медь и цинк, что может мешать определённым ферментативным реакциям.
• Взаимодействие с карбонильными соединениями (например, с альдегидами) может приводить к образованию побочных продуктов.
• Не подходит для использования в кислой среде (pH ниже 6,0), так как буферная ёмкость резко снижается.

¶Альтернативы

В случаях, когда буфер Триса не подходит из-за своих недостатков, используются другие буферные системы:

• HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислота) — для физиологических pH (6,8–8,2), менее чувствителен к температуре.
• PBS (фосфатно-солевой буфер) — для нейтральных pH, часто используется в клеточной биологии.
• MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфокислота) — для pH 6,5–7,9, применяется в электрофорезе РНК.
• Bis-Tris (бис(2-гидроксиэтил)иминотрис(гидроксиметил)метан) — для pH 5,8–7,2, используется в некоторых вариантах электрофореза.

¶Интересные факты

• Трис(гидроксиметил)аминометан является одним из немногих буферов, который может быть использован в качестве первичного стандарта для калибровки pH-метров, так как его растворы имеют точно известное значение pH при определённой температуре.
• В 1970-х годах буфер Триса был использован в экспериментах по изучению структуры ДНК, что способствовало открытию двойной спирали.
• В некоторых странах THAM используется в качестве антидота при отравлении угарным газом, так как он способствует выведению углекислого газа из крови.

¶Источники

• Good, N. E., et al. "Hydrogen ion buffers for biological research." Biochemistry 5.2 (1966): 467-477.
• Sigma-Aldrich. "Tris(hydroxymethyl)aminomethane product information." (2023).
• Sambrook, J., and Russell, D. W. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual." 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
• Lehninger, A. L., Nelson, D. L., and Cox, M. M. "Lehninger Principles of Biochemistry." 7th ed., W. H. Freeman, 2017.
• "THAM (tromethamine) for metabolic acidosis." Drugs.com, 2022.