Фосфатно-солевой буфер¶

Фосфатно-солевой буфер (ФСБ, англ. phosphate-buffered saline, PBS) — это водный буферный раствор, содержащий фосфат натрия, хлорид натрия и, в некоторых рецептурах, хлорид калия. Он используется в биохимии, молекулярной биологии и медицине для поддержания стабильного pH и осмотического давления, близких к физиологическим условиям организма человека и животных. Основное назначение ФСБ — промывка и разведение биологических образцов, клеток и тканей без повреждения их структуры и функции.

¶Состав и рецептура

Фосфатно-солевой буфер представляет собой изотонический раствор, pH которого обычно составляет 7,4 (при 25 °C). Стандартный состав (1× PBS) включает:

• Хлорид натрия (NaCl) — 137 мМ
• Хлорид калия (KCl) — 2,7 мМ
• Фосфат натрия двузамещённый (Na₂HPO₄) — 10 мМ
• Фосфат калия однозамещённый (KH₂PO₄) — 1,8 мМ

Концентрации могут варьироваться в зависимости от производителя и конкретной задачи. Для приготовления 10× PBS (концентрированный раствор) все компоненты берутся в десятикратном количестве. pH раствора доводится до 7,4 с помощью соляной кислоты (HCl) или гидроксида натрия (NaOH).

¶Приготовление

Для приготовления 1 литра 1× PBS:

1. Растворяют 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na₂HPO₄ и 0,24 г KH₂PO₄ в 800 мл дистиллированной воды.
2. Доводят pH до 7,4 с помощью 1M HCl или 1M NaOH.
3. Объём доводят до 1 литра дистиллированной водой.
4. Стерилизуют автоклавированием или фильтрацией через мембрану 0,22 мкм.

¶Физико-химические свойства

Основные свойства ФСБ:

• Буферная ёмкость: обеспечивает стабильность pH в диапазоне 6,8–8,0, что достаточно для большинства биологических экспериментов.
• Осмоляльность: около 280–310 мОсм/кг, что соответствует осмоляльности плазмы крови человека.
• Ионная сила: поддерживает растворение белков и нуклеиновых кислот, предотвращая их агрегацию.
• Температурная стабильность: pH слабо зависит от температуры (изменение около 0,01 единицы на 1 °C).

¶Применение

Фосфатно-солевой буфер является универсальным раствором в лабораторной практике и используется в следующих областях:

¶Промывка клеток и тканей

ФСБ применяется для удаления культуральной среды, сыворотки или других примесей с поверхности клеток перед их фиксацией, лизисом или окрашиванием. Например, в иммуноцитохимии клетки промывают ФСБ перед добавлением антител.

¶Разведение антител и ферментов

Для сохранения активности антител и ферментов их разводят в ФСБ, часто с добавлением бычьего сывороточного альбумина (BSA) или Tween-20 для снижения неспецифического связывания.

¶Иммуноферментный анализ (ELISA)

В ELISA ФСБ используется для промывки планшетов между этапами инкубации с антителами и для разведения реагентов.

¶Вестерн-блоттинг

После переноса белков на мембрану её промывают ФСБ с Tween-20 (PBST) для удаления несвязавшихся антител.

¶Культивирование клеток

ФСБ применяется для кратковременного хранения клеток вне культуральной среды, а также для их отмывки перед трипсинизацией или трансфекцией.

¶Микроскопия

В иммунофлуоресцентной микроскопии ФСБ используется для промывки препаратов после инкубации с флуоресцентными антителами.

¶Разновидности и модификации

Существуют несколько модификаций ФСБ, адаптированных для специфических задач:

• PBS без Ca²⁺ и Mg²⁺: используется для работы с клетками, так как двухвалентные катионы могут активировать некоторые ферменты (например, нуклеазы) или вызывать агрегацию клеток.
• PBS с Ca²⁺ и Mg²⁺: применяется, когда требуется сохранение клеточных контактов или активности некоторых рецепторов.
• PBST (PBS с Tween-20): добавляют 0,05–0,1% Tween-20 для снижения поверхностного натяжения и уменьшения неспецифического связывания в иммунохимических методах.
• DPBS (Dulbecco's PBS): вариант, разработанный Ренато Дульбекко, отличается более высокой концентрацией фосфатов (8,1 мМ Na₂HPO₄, 1,5 мМ KH₂PO₄) и используется в клеточной биологии.

¶Сравнение с другими буферами

ФСБ имеет ряд преимуществ и недостатков по сравнению с другими распространёнными буферами:

ФСБ предпочтителен для работы с клетками, так как его ионный состав близок к плазме крови, в то время как Трис-буфер может быть токсичен для клеток при длительном контакте.

¶Хранение и стабильность

Готовый раствор ФСБ хранится при комнатной температуре (20–25 °C) в течение нескольких месяцев, если он стерилен. Для длительного хранения (до года) рекомендуется температура 4 °C. Не допускается замораживание, так как это может привести к выпадению осадка фосфатов. Концентрированные растворы (10× PBS) стабильны дольше и могут храниться при комнатной температуре.

¶Меры предосторожности

Фосфатно-солевой буфер считается нетоксичным и безопасным для лабораторного использования. Однако при работе с концентрированными растворами (10× PBS) следует избегать попадания на кожу и слизистые оболочки, так как они могут вызывать раздражение. Все растворы, контактирующие с биологическими образцами, должны быть стерильными.

¶Историческая справка

Фосфатно-солевой буфер был впервые описан в 1950-х годах в работах, посвящённых культивированию клеток млекопитающих. Его состав был оптимизирован для поддержания жизнеспособности клеток в условиях _in vitro_. Широкое распространение ФСБ получил после внедрения методов иммунохимического анализа в 1970-х годах.

¶Источники

1. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2. Freshney, R. I. (2010). Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (6th ed.). Wiley-Blackwell.
3. Dulbecco, R., & Vogt, M. (1954). Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. Journal of Experimental Medicine, 99(2), 167–182.
4. Harlow, E., & Lane, D. (1988). Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
5. Sigma-Aldrich. (2023). Product Information: Phosphate Buffered Saline (PBS). Merck KGaA.