CMR

CMR (от англ. Cytopathic effect — цитопатическое действие) — это стандартная международная система классификации степени цитопатического действия вирусов на клеточные культуры, а также вирусологический термин, обозначающий специфические морфологические изменения клеток, вызванные репродукцией вируса.

Определение и суть метода

CMR представляет собой шкалу для оценки интенсивности разрушения клеток в монослое культуры ткани под воздействием вируса. Система широко применяется в вирусологии для титрования вирусов, определения их инфекционной активности и оценки эффективности противовирусных препаратов. Шкала CMR обычно варьируется от 0 до 4, где:

• 0 — отсутствие цитопатического эффекта;
• 1 — слабое поражение (до 25 % клеток);
• 2 — умеренное поражение (25–50 %);
• 3 — сильное поражение (50–75 %);
• 4 — полное разрушение монослоя (75–100 %).

В некоторых лабораториях используется дробная шкала (например, CMR 1+, CMR 2+, CMR 3+). Степень CMR определяется визуально при микроскопии или с помощью автоматизированных систем анализа изображений.

История

Метод оценки цитопатического действия вирусов на клеточные культуры был разработан в середине XX века, одновременно с внедрением культуры тканей в вирусологическую практику. Первые систематические описания CMR относятся к 1950-м годам, когда вирусологи начали количественно оценивать повреждение клеток, вызванное вирусами полиомиелита, гриппа и аденовирусами.

Одним из основоположников метода считается американский вирусолог Томас Фрэнсис-младший (Thomas Francis Jr.), который в 1950-х годах разработал протоколы для титрования вируса гриппа с использованием CMR. В 1960-х годах шкала CMR стала общепринятой, а её применение было стандартизировано Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ).

Механизм цитопатического действия

Цитопатическое действие вируса обусловлено несколькими механизмами:

1. Лизис клеток — вирус разрушает клеточную мембрану, вызывая гибель клетки. Характерно для многих РНК-вирусов (например, энтеровирусов, реовирусов).
2. Слияние клеток — образование синцитиев (многоядерных клеток), типичное для парамиксовирусов, герпесвирусов, ВИЧ.
3. Внутриклеточные включения — накопление вирусных белков или нуклеиновых кислот в цитоплазме или ядре (например, тельца Бабеша—Негри при бешенстве, тельца Гварниери при оспе).
4. Апоптоз — программируемая гибель клетки, индуцируемая вирусом.

Классификация по типу CMR

В зависимости от вируса и типа клеток различают несколько морфологических вариантов CMR:

Лизис

Клетки округляются, сморщиваются, теряют контакт с субстратом и разрушаются. Монослой приобретает «сетчатую» структуру. Характерен для энтеровирусов (полиовирус, вирус Коксаки), аденовирусов, вируса краснухи.

Синцитий

Клетки сливаются, образуя гигантские многоядерные структуры. Монослой трансформируется в сеть из крупных масс. Характерен для вируса кори, респираторно-синцитиального вируса (РСВ), вируса простого герпеса (ВПГ), вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Включения

На фоне неизменённого монослоя в цитоплазме или ядре клеток выявляются четко ограниченные включения — скопления вирусных частиц или их компонентов. Характерные примеры: цитомегаловирус (ЦМВ) — внутриядерные включения («совиный глаз»), вирус бешенства — цитоплазматические тельца Негри.

Фокусы трансформации

При онкогенных вирусах (например, вирус папилломы человека, вирус Эпштейна—Барр) CMR проявляется не гибелью, а морфологической трансформацией клеток — они становятся округлыми, утрачивают контактное торможение, формируют фокусы неориентированного роста.

Применение

CMR используется в следующих областях:

Титрование вирусов

Метод титрования по CMR основан на определении 50 % тканевой цитопатической дозы (ТЦД50 или TCID50). Вирусный материал серийно разводят и вносят в культуру клеток. После инкубации регистрируют CMR. Рассчитывают разведение, при котором CMR достигает 50 % (например, по методу Рида—Менча или Спирмена—Кёрбера).

Оценка эффективности противовирусных препаратов

В присутствии тестируемого препарата вирус может вызывать меньшую степень CMR по сравнению с контролем. Снижение CMR служит косвенным показателем противовирусной активности. Метод широко применяется при скрининге лекарственных средств (например, при тестировании ремдесивира, фавипиравира, осельтамивира).

Идентификация и дифференциация вирусов

Разные вирусы вызывают разный тип CMR. По характеру ЦПД (цитопатического действия) можно предположить видовую принадлежность вируса. Например, характерный синцитий при РСВ или «совиный глаз» при ЦМВ являются патогномоничными признаками.

Контроль стерильности

В фармацевтической промышленности CMR используется для контроля стерильности вакцин, сывороток и других биологических препаратов. Отсутствие CMR (стерильность) подтверждает безопасность.

Ограничения и критика

Несмотря на широкое применение, метод CMR имеет ряд ограничений:

• Субъективность — визуальная оценка зависит от квалификации лаборанта.
• Низкая чувствительность — некоторые вирусы вызывают слабое или отсроченное CMR (например, вирус гепатита C, ВИЧ в некоторых клетках).
• Зависимость от типа клеток — CMR может различаться на разных линиях клеток, что затрудняет стандартизацию.
• Невозможность титрования нецитопатогенных вирусов — например, некоторых флавивирусов, вируса гепатита B.

В последние годы для титрования все чаще применяются более чувствительные методы: ПЦР в реальном времени, иммуноферментный анализ (ИФА), проточная цитометрия, методы на основе люциферазы.

Интересные факты

• CMR является биологическим аналогом бляшкообразования в клеточной культуре — метод бляшек (Plaque assay) считается «золотым стандартом» титрования, но требует агарозного покрытия, что замедляет работу.
• В некоторых лабораториях шкалу CMR расширяют до 5 или 6 уровней, чтобы детализировать слабое поражение (например, CMR 0.5).
• CMR активно использовалось при разработке вакцин от полиомиелита — Сейбин и Солк оценивали степень цитопатического эффекта при тестировании живых и инактивированных штаммов.

Источники

• Leland D. S., Ginocchio C. C. «Role of cell culture for virus detection in the age of technology» // Clinical Microbiology Reviews, 2007.
• Машков О. А. «Методы культивирования вирусов» // Медицинская вирусология, Москва, 2015.
• Hierholzer J. C. «Cytopathic effects of viruses on cell cultures» // Journal of Clinical Microbiology, 1976.
• Lennette E. H., Schmidt N. J. «Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections» // American Public Health Association, 1979.
• Пузырёва В. П. «Основы вирусологии» // Санкт-Петербург, 2010.