ДНК-лигаза

ДНК-лигаза — это фермент класса лигаз, катализирующий образование фосфодиэфирной связи между 3'-гидроксильной и 5'-фосфатной группами соседних нуклеотидов в цепи ДНК. Ключевая функция ДНК-лигазы заключается в соединении (сшивании) разрывов в сахарофосфатном остове молекулы ДНК, что необходимо для репарации повреждений, репликации и рекомбинации генетического материала. ДНК-лигазы обнаружены во всех живых организмах — от бактерий и архей до эукариот, включая человека, а также у многих вирусов.

История открытия

Впервые ДНК-лигаза была выделена и охарактеризована в 1967 году независимо друг от друга несколькими группами исследователей: в лабораториях Мартина Геллерта (США), Бернарда Вайсмана и И. Р. Лемана (США), а также в лаборатории Пола Берга (США). Первоначально фермент был обнаружен в клетках кишечной палочки (Escherichia coli). Открытие ДНК-лигазы стало важным этапом в понимании молекулярных механизмов репарации ДНК и репликации, а также заложило основу для развития методов генной инженерии, поскольку именно этот фермент позволяет «сшивать» фрагменты ДНК in vitro.

Строение и механизм действия

ДНК-лигазы представляют собой крупные белки, состоящие из нескольких доменов. У эукариот и архей они, как правило, имеют более сложную структуру, чем у бактерий. Молекулярная масса бактериальных ДНК-лигаз составляет около 70–80 кДа, а эукариотических — от 100 до 200 кДа.

Механизм реакции включает три последовательных этапа:

1. Активация фермента. ДНК-лигаза взаимодействует с кофактором — аденозинтрифосфатом (АТФ) у эукариот, архей и вирусов или никотинамидадениндинуклеотидом (НАД⁺) у бактерий. В результате образуется ковалентный комплекс лигаза-АМФ (аденилат лигазы), при этом высвобождается пирофосфат (из АТФ) или никотинамидмононуклеотид (из НАД⁺).
2. Перенос аденилата на ДНК. Аденилированная лигаза связывается с разрывом в ДНК. АМФ переносится на 5'-фосфатную группу одного из концов разрыва, образуя высокоэнергетическую промежуточную связь (5'-фосфоаденилат).
3. Лигирование. 3'-гидроксильная группа второго конца разрыва атакует фосфоаденилатную связь, образуя новую фосфодиэфирную связь и высвобождая АМФ. Фермент диссоциирует от восстановленной молекулы ДНК.

Для работы ДНК-лигазы необходимо наличие двухцепочечной ДНК с одноцепочечным разрывом (ник), при этом оба конца разрыва должны быть правильно спарены с комплементарной цепью. Фермент не способен соединять одноцепочечные молекулы ДНК.

Классификация

ДНК-лигазы классифицируют по типу используемого кофактора и по структурным особенностям:

По типу кофактора

• НАД⁺-зависимые ДНК-лигазы. Характерны исключительно для бактерий и некоторых вирусов (например, бактериофагов). Используют в качестве донора энергии никотинамидадениндинуклеотид (НАД⁺). Этот тип ферментов является потенциальной мишенью для антибактериальных препаратов, так как у эукариот он отсутствует.
• АТФ-зависимые ДНК-лигазы. Встречаются у эукариот, архей, вирусов и некоторых бактерий. Используют аденозинтрифосфат (АТФ) в качестве кофактора. К этому типу относятся все ДНК-лигазы человека.

У эукариот (на примере человека)

У человека известно несколько изоформ ДНК-лигазы, различающихся по локализации и функциям:

• ДНК-лигаза I (LIG1). Основной фермент репликации. Участвует в сшивании фрагментов Оказаки на отстающей цепи ДНК, а также в некоторых путях репарации (эксцизионная репарация оснований, BER).
• ДНК-лигаза III (LIG3). Участвует в репарации митохондриальной ДНК и в некоторых процессах репарации ядерной ДНК (BER). Взаимодействует с белком XRCC1.
• ДНК-лигаза IV (LIG4). Ключевой фермент нетомологичного соединения концов (NHEJ) — основного пути репарации двуцепочечных разрывов ДНК у млекопитающих. Взаимодействует с белком XRCC4. Мутации в гене LIG4 вызывают редкое заболевание — синдром LIG4, характеризующийся иммунодефицитом, радиочувствительностью и задержкой развития.

Функции в клетке

ДНК-лигаза выполняет фундаментальные функции в поддержании целостности генома:

• Репликация ДНК. Сшивает фрагменты Оказаки на отстающей цепи в процессе репликации. Без ДНК-лигазы репликация не может быть завершена.
• Репарация ДНК. Участвует в большинстве путей репарации, включая эксцизионную репарацию оснований (BER), эксцизионную репарацию нуклеотидов (NER) и репарацию двуцепочечных разрывов (NHEJ и гомологичная рекомбинация).
• Рекомбинация ДНК. Необходима для соединения разрывов, возникающих в процессе V(D)J-рекомбинации, которая формирует разнообразие антител и Т-клеточных рецепторов у позвоночных.
• Поддержание теломер. Участвует в процессе репликации концов хромосом (теломер), где также требуется сшивание разрывов.

Применение в биотехнологии и генной инженерии

ДНК-лигаза является одним из ключевых инструментов молекулярной биологии и генной инженерии. Наиболее широко используется Т4-ДНК-лигаза, выделенная из бактериофага Т4. Она является АТФ-зависимой и способна лигировать как липкие (с выступающими комплементарными концами), так и тупые концы ДНК.

Основные области применения:

• Клонирование. Вставка фрагмента ДНК (гена) в плазмидный вектор с последующим сшиванием концов.
• Сборка генов и геномов. Соединение нескольких синтетических или природных фрагментов ДНК в заданном порядке.
• Создание рекомбинантных ДНК. Сборка химерных молекул, состоящих из фрагментов разного происхождения.
• Лигирование адаптеров и линкеров. Присоединение коротких синтетических олигонуклеотидов к концам ДНК-фрагментов для последующего секвенирования или амплификации.
• Метод Ligation Detection Reaction (LDR). Используется для обнаружения точечных мутаций в геноме.

Ингибиторы и медицинское значение

Поскольку ДНК-лигазы необходимы для выживания клеток, их ингибиторы рассматриваются как потенциальные противоопухолевые и антибактериальные препараты.

• Антибактериальные средства. НАД⁺-зависимые ДНК-лигазы бактерий являются перспективной мишенью для разработки новых антибиотиков, так как они структурно отличаются от АТФ-зависимых лигаз человека. Несколько классов ингибиторов (например, производные ариламино-пиримидинов) находятся на стадии доклинических исследований.
• Противоопухолевые препараты. Ингибиторы ДНК-лигаз (особенно LIG1 и LIG4) могут повышать чувствительность раковых клеток к химиотерапии и лучевой терапии, блокируя репарацию повреждений ДНК. Например, ингибитор LIG1 — соединение SCR7 — показал эффективность в экспериментальных моделях.

Интересные факты

• ДНК-лигаза является единственным ферментом, который может соединять две молекулы ДНК, не требуя матрицы. Все остальные ферменты, работающие с ДНК (полимеразы, нуклеазы), требуют либо матрицы, либо специфической последовательности.
• В 2010 году группа ученых под руководством Крейга Вентера использовала ДНК-лигазу для сборки синтетического генома бактерии Mycoplasma mycoides, что стало первым случаем создания искусственной клетки.
• Некоторые вирусы, например, вирус оспы, кодируют собственную ДНК-лигазу, которая необходима для репликации их генома в клетке хозяина.

Источники

• Lehman, I. R. (1974). DNA ligase: structure, mechanism, and function. Science, 186(4166), 790–797.
• Tomkinson, A. E., & Mackey, Z. B. (1998). Structure and function of mammalian DNA ligases. Mutation Research/DNA Repair, 407(1), 1–9.
• Ellenberger, T., & Tomkinson, A. E. (2008). Eukaryotic DNA ligases: structural and functional insights. Annual Review of Biochemistry, 77, 313–338.
• Shuman, S. (2009). DNA ligases: progress and prospects. Journal of Biological Chemistry, 284(26), 17365–17369.
• Howes, T. R., & Tomkinson, A. E. (2012). DNA ligase I, the replicative DNA ligase. Subcellular Biochemistry, 62, 107–126.
• Sriskanda, V., & Shuman, S. (1998). Mutational analysis of the bacteriophage T4 DNA ligase. Journal of Biological Chemistry, 273(31), 19552–19558.