Фрагменты Оказаки

Фрагменты Оказаки — это короткие одноцепочечные фрагменты ДНК, образующиеся на отстающей цепи в процессе репликации ДНК у эукариот и прокариот. Они синтезируются в направлении от 5'-конца к 3'-концу, противоположном общему направлению движения репликационной вилки, и впоследствии сшиваются в непрерывную цепь. Длина фрагментов Оказаки варьируется в зависимости от организма: у бактерий она составляет 1000–2000 нуклеотидов, у эукариот — 100–200 нуклеотидов.

История открытия

Фрагменты Оказаки были открыты в 1968 году японскими молекулярными биологами Рейдзи Оказаки и Цунеко Оказаки (супругами) в ходе экспериментов на бактериях Escherichia coli. Исследователи использовали метод импульсного мечения ДНК радиоактивным тимидином с последующим анализом продуктов репликации. В результате они обнаружили, что новосинтезированная ДНК на одной из цепей представлена не непрерывной молекулой, а набором коротких фрагментов, которые со временем объединяются в длинную цепь. Это открытие подтвердило полуконсервативный механизм репликации ДНК, предложенный Уотсоном и Криком, и объяснило, как антипараллельность цепей ДНК преодолевается при репликации.

Механизм образования

Репликационная вилка и антипараллельность

Репликация ДНК происходит в репликационной вилке — области, где родительская двойная спираль раскручивается. ДНК-полимераза способна синтезировать новую цепь только в направлении 5'→3', добавляя нуклеотиды к 3'-гидроксильной группе. Поскольку две цепи родительской ДНК антипараллельны (одна ориентирована 5'→3', другая 3'→5'), репликация на них протекает по-разному:

• Лидирующая цепь (ведущая) синтезируется непрерывно в направлении движения репликационной вилки (5'→3').
• Отстающая цепь (запаздывающая) синтезируется прерывисто, фрагментами, в направлении, противоположном движению вилки (3'→5').

Этапы синтеза фрагментов Оказаки

1. Инициация: На отстающей цепи фермент праймаза (ДНК-зависимая РНК-полимераза) синтезирует короткий РНК-праймер (10–12 нуклеотидов у эукариот, 4–5 у прокариот), комплементарный матрице. Праймер обеспечивает 3'-OH-группу для начала работы ДНК-полимеразы.
2. Элонгация: ДНК-полимераза III (у прокариот) или ДНК-полимераза δ/ε (у эукариот) удлиняет праймер, добавляя дезоксирибонуклеотиды, пока не достигнет предыдущего фрагмента. Образуется фрагмент Оказаки.
3. Удаление праймера: РНК-праймер удаляется ферментами: у прокариот — ДНК-полимераза I (обладает 5'→3'-экзонуклеазной активностью), у эукариот — РНКаза H1 и FEN1 (флэп-эндонуклеаза). Образовавшаяся брешь заполняется ДНК-полимеразой.
4. Лигирование: Фермент ДНК-лигаза сшивает соседние фрагменты Оказаки, образуя фосфодиэфирную связь между 3'-OH-концом одного фрагмента и 5'-фосфатом другого. В результате отстающая цепь становится непрерывной.

Характеристики и особенности

Длина фрагментов

Длина фрагментов Оказаки зависит от частоты инициации синтеза праймеров и скорости репликации. У прокариот, где репликация происходит быстрее (до 1000 нуклеотидов в секунду), фрагменты длиннее. У эукариот, где репликация медленнее (50–100 нуклеотидов в секунду), фрагменты короче. У человека длина фрагментов составляет около 100–200 нуклеотидов.

Количество фрагментов

При репликации всего генома E. coli (4,6 млн пар оснований) образуется около 2000–4000 фрагментов Оказаки. У человека, с его геномом в 3,2 млрд пар оснований, количество фрагментов может достигать десятков миллионов.

Роль топоизомераз и хеликаз

В процессе синтеза фрагментов Оказаки участвуют вспомогательные ферменты:

• Хеликазы раскручивают двойную спираль ДНК.
• Топоизомеразы (например, ДНК-гираза у прокариот) снимают суперспирализацию, возникающую при раскручивании.
• SSB-белки (одноцепочечные ДНК-связывающие белки) стабилизируют одноцепочечные участки на отстающей цепи, предотвращая их повторное спаривание.

Значение в биологии

Обеспечение точности репликации

Фрагментарный синтез отстающей цепи позволяет избежать ошибок, связанных с антипараллельностью. Без этого механизма репликация была бы невозможна, так как ДНК-полимераза не может синтезировать цепь в направлении 3'→5'.

Регуляция репликации

Образование фрагментов Оказаки тесно связано с циклическими процессами в клетке. У эукариот репликация ДНК происходит только в S-фазе клеточного цикла. Скорость синтеза фрагментов и их сшивка регулируются белками, такими как циклин-зависимые киназы (CDK).

Роль в репарации ДНК

Фрагменты Оказаки могут служить субстратом для механизмов репарации. Например, при повреждении отстающей цепи (например, разрывах) сшивка фрагментов может быть нарушена, что активирует пути репарации, такие как гомологичная рекомбинация.

Связь с заболеваниями

Нарушения в процессе образования или сшивки фрагментов Оказаки могут приводить к генетической нестабильности и заболеваниям. Например:

• Синдром Блума — редкое наследственное заболевание, вызванное мутациями в гене BLM, кодирующем хеликазу. Это приводит к повышенной частоте разрывов ДНК и дефектам сшивки фрагментов.
• Атаксия-телеангиэктазия — заболевание, связанное с мутациями в гене ATM, участвующем в репарации двуцепочечных разрывов. Нарушение сшивки фрагментов Оказаки может усугублять повреждения ДНК.
• Синдром Вернера — преждевременное старение, вызванное дефектами в хеликазе WRN, которая участвует в репликации и репарации.

Интересные факты

• Название «фрагменты Оказаки» было предложено в 1968 году в статье, опубликованной в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences. Сами исследователи первоначально называли их «репликативными единицами».
• У некоторых вирусов (например, бактериофага φX174) репликация ДНК происходит без образования фрагментов Оказаки, так как их геном представлен одноцепочечной ДНК.
• В 1970 году Рейдзи Оказаки получил премию Японской академии наук за открытие фрагментов, но не дожил до Нобелевской премии (скончался в 1975 году).
• У эукариот фрагменты Оказаки часто ассоциированы с нуклеосомами — белковыми структурами, упаковывающими ДНК. Синтез фрагментов может быть скоординирован с ремоделированием хроматина.

Источники

• Оказаки Р., Оказаки Т. «Механизм репликации ДНК у E. coli». Proceedings of the National Academy of Sciences, 1968.
• Альбертс Б. и др. «Молекулярная биология клетки», 6-е издание. Гарленд Сайенс, 2014.
• Льюин Б. «Гены IX». Джонс и Бартлетт, 2007.
• Кемпбелл Н., Рис Дж. «Биология», 9-е издание. Бенджамин Каммингс, 2011.