ДНК-полимераза I

ДНК-полимераза I — это фермент класса трансфераз, катализирующий синтез дочерней цепи ДНК на матрице родительской цепи. Относится к семейству ДНК-полимераз А-типа. Впервые была выделена и охарактеризована в 1956 году Артуром Корнбергом из клеток кишечной палочки Escherichia coli, за что он в 1959 году получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине. ДНК-полимераза I играет ключевую роль в репликации, репарации и рекомбинации ДНК у прокариот.

История открытия

Открытие ДНК-полимеразы I стало результатом систематических исследований биохимии нуклеиновых кислот. В 1955 году Артур Корнберг и его коллеги в Вашингтонском университете в Сент-Луисе начали поиск ферментов, способных синтезировать ДНК. Используя радиоактивно меченые нуклеотиды, они обнаружили в экстрактах E. coli активность, которая включала их в полимер в присутствии матричной ДНК. В 1956 году был опубликован первый доклад о выделении фермента, названного «ДНК-полимераза». Позднее, после обнаружения других ДНК-полимераз, этот фермент получил название ДНК-полимераза I (Pol I).

В 1960-х годах группа Корнберга детально изучила механизм действия фермента, включая его способность к коррекции ошибок (3'→5'-экзонуклеазная активность) и удалению РНК-затравок (5'→3'-экзонуклеазная активность). В 1969 году Джон Кэрнс и его коллеги показали, что Pol I не является единственной репликативной полимеразой в E. coli, а её основная функция связана с репарацией и достройкой фрагментов Оказаки. В 1970-х годах были получены мутантные штаммы E. coli с дефектом Pol I, что подтвердило её необязательность для репликации, но критическую роль для выживания клеток при повреждениях ДНК.

Структура и доменная организация

ДНК-полимераза I E. coli представляет собой одноцепочечный полипептид, состоящий из 928 аминокислотных остатков, с молекулярной массой около 109 кДа. Фермент имеет характерную структуру, напоминающую «правую руку», с тремя основными доменами: пальцы, ладонь и большой палец. Эта структура обеспечивает точное позиционирование матрицы и нуклеотидов.

Протеолиз с помощью субтилизина расщепляет Pol I на два фрагмента:

• Большой фрагмент (фрагмент Кленова) — содержит 605 аминокислотных остатков (C-конец). Обладает 5'→3'-полимеразной и 3'→5'-экзонуклеазной (корректирующей) активностями. Широко используется в молекулярной биологии для синтеза ДНК и мечения.
• Малый фрагмент — содержит 323 аминокислотных остатка (N-конец). Обладает 5'→3'-экзонуклеазной активностью, необходимой для удаления РНК-затравок и репарации.

Каталитические активности

ДНК-полимераза I обладает тремя различными ферментативными активностями, локализованными в разных доменах:

5'→3'-полимеразная активность

Основная функция — синтез новой цепи ДНК в направлении от 5'- к 3'-концу. Фермент использует одноцепочечную матрицу ДНК и затравку (праймер) с 3'-ОН-концом. Присоединение дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP) происходит по принципу комплементарности: аденин (A) спаривается с тимином (T), гуанин (G) — с цитозином (C). Скорость полимеризации у Pol I составляет около 600 нуклеотидов в минуту, что значительно ниже, чем у репликативных полимераз (например, Pol III).

3'→5'-экзонуклеазная активность (коррекция ошибок)

Эта активность обеспечивает точность репликации. Если полимераза ошибочно включает некомплементарный нуклеотид, то из-за нарушения геометрии двойной спирали цепь отходит от активного центра. 3'→5'-экзонуклеаза отщепляет неправильно включённый нуклеотид, после чего полимераза повторяет попытку. Благодаря этой корректирующей функции частота ошибок Pol I составляет около 10⁻⁷ на нуклеотид.

5'→3'-экзонуклеазная активность

Эта активность позволяет удалять РНК-затравки (праймеры) и замещать их ДНК. Она также участвует в репарации повреждений, удаляя короткие фрагменты ДНК с повреждёнными основаниями. В отличие от 3'→5'-активности, 5'→3'-экзонуклеаза может работать как на одноцепочечной, так и на двухцепочечной ДНК.

Функции в клетке

Репликация ДНК

В процессе репликации хромосомы E. coli Pol I выполняет вспомогательную роль. Основная репликативная полимераза — ДНК-полимераза III (Pol III) — синтезирует лидирующую и отстающую цепи. Однако Pol III не может удалять РНК-затравки, которые остаются на отстающей цепи после завершения синтеза фрагментов Оказаки. Pol I, используя свою 5'→3'-экзонуклеазу, удаляет эти затравки и одновременно достраивает ДНК, заполняя образовавшиеся пробелы. После этого ники (разрывы в сахарофосфатном остове) сшиваются ДНК-лигазой.

Репарация ДНК

Pol I является ключевым ферментом в нескольких путях репарации:

• Эксцизионная репарация оснований (BER) — удаляет повреждённые или неправильные основания. Гликозилаза вырезает основание, AP-эндонуклеаза делает разрыв, а Pol I вставляет правильный нуклеотид и удаляет 5'-конец повреждённого участка.
• Эксцизионная репарация нуклеотидов (NER) — удаляет крупные повреждения, такие как тиминовые димеры, вызванные ультрафиолетом. Pol I заполняет образовавшуюся брешь длиной 12-13 нуклеотидов.
• Репарация разрывов — Pol I может заделывать одноцепочечные разрывы, используя противоположную цепь как матрицу.

Рекомбинация

В процессе гомологичной рекомбинации Pol I участвует в залечивании разрывов, возникающих при обмене цепями между гомологичными молекулами ДНК.

Применение в молекулярной биологии

ДНК-полимераза I и её производные, особенно фрагмент Кленова, являются одними из наиболее широко используемых ферментов в лабораторной практике.

Фрагмент Кленова

Получается путём протеолитического расщепления Pol I или экспрессии укороченного гена. Обладает полимеразной и 3'→5'-корректирующей активностями, но лишён 5'→3'-экзонуклеазы. Применяется для:

• Синтеза второй цепи кДНК при клонировании.
• Заполнения липких концов (достройка 5'-выступающих концов до тупых).
• Синтеза ДНК-зондов с радиоактивной или флуоресцентной меткой.
• Секвенирования по Сэнгеру (в классическом варианте).
• Сайт-направленного мутагенеза (второй этап).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Хотя для ПЦР чаще используют термостабильные полимеразы (например, Taq-полимеразу), Pol I исторически применялась в первых экспериментах. Однако из-за термолабильности (инактивация при температурах выше 70°C) её использование в ПЦР ограничено.

Репарация ДНК in vitro

Pol I используется для залечивания одноцепочечных разрывов в плазмидах и других двухцепочечных молекулах ДНК.

Регуляция и эволюция

У E. coli ген polA, кодирующий ДНК-полимеразу I, является конститутивным, то есть экспрессируется постоянно. Однако его уровень может возрастать при повреждениях ДНК, индуцируя SOS-ответ. Мутации в гене polA приводят к повышенной чувствительности к ультрафиолету и химическим мутагенам, а также к увеличению частоты рекомбинации.

ДНК-полимераза I относится к семейству А-полимераз, которое включает также полимеразы бактериофагов (например, T7-полимераза) и митохондриальные полимеразы эукариот (Pol γ). У эукариот гомологи Pol I не обнаружены; их функции репарации и репликации митохондриальной ДНК выполняют другие ферменты. У бактерий Pol I является одним из наиболее консервативных ферментов, хотя её размер и доменная организация могут варьировать.

Интересные факты

• ДНК-полимераза I была первым ферментом, синтезировавшим ДНК в пробирке. В 1967 году группа Корнберга с её помощью in vitro синтезировала полноценную инфекционную ДНК бактериофага φX174, что стало первым примером искусственного синтеза вирусного генома.
• Фрагмент Кленова назван в честь датского биохимика Ханса Кленова, который в 1970 году впервые описал метод его получения путём ограниченного протеолиза.
• Несмотря на то, что Pol I не является основной репликативной полимеразой, мутанты с полным отсутствием этого фермента (ΔpolA) нежизнеспособны, что указывает на его критическую роль в репарации.

Источники

• Kornberg, A. (1974). DNA Synthesis. W. H. Freeman and Company.
• Lehman, I. R. (2003). Discovery of DNA polymerase. Journal of Biological Chemistry, 278(38), 36101-36108.
• Joyce, C. M., & Steitz, T. A. (1994). Function and structure relationships in DNA polymerases. Annual Review of Biochemistry, 63, 777-822.
• Klenow, H., & Henningsen, I. (1970). Selective elimination of the exonuclease activity of the deoxyribonucleic acid polymerase from Escherichia coli B by limited proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 65(1), 168-175.
• Patel, P. H., & Loeb, L. A. (2001). Getting a grip on how DNA polymerases function. Nature Structural Biology, 8(8), 656-659.