Двухфазная фиксация

Двухфазная фиксация — это метод консервации и стабилизации биологических тканей (преимущественно трупного материала), при котором процесс фиксации разделён на два последовательных этапа с использованием различных химических растворов. Основная цель метода — обеспечить длительное сохранение морфологической структуры тканей, предотвратить их гниение и автолиз, а также придать материалу необходимые физические свойства (эластичность, плотность, цвет) для последующего изучения, хранения или демонстрации. Двухфазная фиксация широко применяется в патологической анатомии, судебной медицине, музейном деле и при изготовлении анатомических препаратов.

История

Метод двухфазной фиксации возник как развитие классических методов бальзамирования и консервации, известных с древности. В XIX веке с развитием формалиновой фиксации (изобретение формалина приписывается Августу Вильгельму фон Гофману, 1868 год) стало возможным надёжное сохранение тканей, однако формалин имел существенные недостатки: он делал ткани жёсткими, обесцвечивал их и вызывал усадку. Это затрудняло как микроскопическое исследование, так и создание музейных экспонатов.

В начале XX века, особенно в работах немецкого анатома Гюнтера фон Хагенса (Gunther von Hagens), разработавшего технику пластинации, и его предшественников, была осознана необходимость комбинирования разных фиксаторов. Первая фаза, как правило, включала формалин для быстрой остановки разложения и фиксации белков. Вторая фаза — использование спиртов, глицерина, фенола или специальных полимерных составов для восстановления эластичности, цвета и придания препарату долговечности.

В советской и российской патологоанатомической школе метод двухфазной фиксации был стандартизирован в середине XX века. Он активно применялся для создания учебных и музейных коллекций в медицинских вузах (например, в музеях кафедр патологической анатомии и судебной медицины). Классические прописи растворов для двухфазной фиксации были разработаны такими учёными, как А. И. Абрикосов, И. В. Давыдовский, М. Ф. Глазунов.

Суть метода

Двухфазная фиксация отличается от однофазной (например, только в формалине или только в спирте) тем, что позволяет последовательно решить две разные задачи:

1. Первая фаза (первичная фиксация): Быстрая и надёжная фиксация белков, остановка ферментативных процессов (автолиза) и бактериального разложения. Обычно для этого используется 10–20% раствор нейтрального формалина. Формалин (водный раствор формальдегида) образует поперечные сшивки между белковыми молекулами, «замораживая» структуру ткани. Длительность первой фазы — от нескольких дней до нескольких недель в зависимости от размера объекта.
2. Вторая фаза (дофиксация, уплотнение, окрашивание и консервация): Обработка ткани специальным раствором, который удаляет избыток формалина, восстанавливает естественную эластичность и цвет (часто используется спирт-глицериновая смесь с добавлением фенола или камфоры), а также придаёт препарату устойчивость к высыханию и плесени. В некоторых методиках вторая фаза включает окрашивание тканей (например, для демонстрации сосудистого русла) или импрегнацию полимерами (как в пластинации).

Техника выполнения

Процесс двухфазной фиксации включает несколько этапов:

Подготовка материала

Орган или фрагмент ткани промывают от крови, при необходимости препарируют (удаляют излишки жира, фасции). Для крупных объектов (например, целые органы: сердце, лёгкое, печень) делают насечки или вскрывают полости для лучшего проникновения фиксатора.

Первая фаза: формалиновая фиксация

Объект помещают в 10–20% раствор нейтрального формалина (pH 7,0–7,4). Объём раствора должен превышать объём ткани в 10–20 раз. Фиксация проводится при комнатной температуре. Для ускорения процесса используют вакуумную фиксацию или перфузию через сосуды. Длительность — не менее 2–4 недель для стандартных препаратов, для крупных объектов (например, целая конечность) — до нескольких месяцев. Признаком завершения первой фазы является равномерное уплотнение ткани и отсутствие запаха разложения.

Промежуточная промывка

После формалиновой фиксации ткань промывают в проточной воде в течение 1–3 суток для удаления избытка формальдегида. Это предотвращает образование кристаллов параформальдегида и снижает токсичность препарата.

Вторая фаза: спирт-глицериновая консервация

Объект помещают в раствор следующего состава (классическая пропись, используемая в российских патологоанатомических бюро):

• Этиловый спирт 96% — 50–70 частей.
• Глицерин — 20–30 частей.
• Фенол (кристаллический) — 5–10 частей.
• Вода дистиллированная — до 100 частей.

Фенол выступает как антисептик и предотвращает рост плесени. Глицерин и спирт придают тканям эластичность и предохраняют от высыхания. Длительность второй фазы — от 2 недель до 2 месяцев. Раствор периодически меняют. Готовый препарат хранят в герметично закрытом сосуде с этим же раствором.

Альтернативные варианты второй фазы

• Метод Кайзера: Использование глицерина с добавлением желатина для придания блеска.
• Метод Шора: Обработка спиртом с последующим помещением в смесь глицерина и уксуснокислого калия.
• Пластинация: Вторая фаза включает обезвоживание в ацетоне и последующую пропитку силиконовыми или эпоксидными полимерами (метод Гюнтера фон Хагенса).

Преимущества и недостатки

Преимущества

• Долговременное сохранение: Препараты, обработанные по двухфазной методике, могут храниться десятки лет без существенных изменений.
• Сохранение естественного цвета: Вторая фаза позволяет частично восстановить природную окраску тканей (например, лёгкие становятся розоватыми, печень — коричневой), что важно для музейных экспонатов.
• Эластичность: В отличие от «дубовых» формалиновых препаратов, ткани после второй фазы остаются эластичными, что позволяет проводить препаровку и демонстрацию.
• Устойчивость к биоповреждениям: Фенол и спирт подавляют рост бактерий и грибков.
• Удобство для микроскопии: Фиксация формалином обеспечивает хорошую сохранность клеточных структур, а последующая обработка спиртами улучшает проникновение парафина при гистологической проводке.

Недостатки

• Токсичность: Формалин, спирт и фенол являются токсичными веществами. Работа требует вытяжной вентиляции и средств индивидуальной защиты.
• Длительность: Полный цикл фиксации занимает от нескольких недель до месяцев.
• Усадка: Формалин вызывает незначительную усадку тканей (на 5–10%).
• Сложность для очень крупных объектов: Требуется специальное оборудование (вакуумные камеры, перфузионные системы).
• Необходимость герметичного хранения: Препараты должны храниться в закрытых сосудах, так как спирт и глицерин испаряются.

Применение

В патологической анатомии и судебной медицине

• Создание архивных и учебных коллекций макропрепаратов.
• Демонстрация типичных патологических процессов (инфаркты, опухоли, пороки развития, травмы).
• Подготовка препаратов для судебно-медицинской экспертизы (например, изъятые органы для повторного исследования).

В музейном деле

• Экспонаты в анатомических и патологоанатомических музеях (например, Музей патологической анатомии человека в Москве, Музей антропологии и этнографии им. Петра Великого (Кунсткамера)).
• Демонстрация сравнительной анатомии (органы животных и человека).

В образовании

• Использование фиксированных препаратов на практических занятиях по анатомии, гистологии, патологической анатомии и судебной медицине.

В научных исследованиях

• Консервация биологического материала для последующего гистологического, иммуногистохимического или молекулярно-биологического анализа.

Современные модификации

В XXI веке двухфазная фиксация часто заменяется более современными методами, такими как пластинация (позволяет получить сухие, прочные и нетоксичные экспонаты) или криоконсервация. Однако традиционная двухфазная методика остаётся «золотым стандартом» для рутинной консервации в патологоанатомических отделениях и музеях благодаря своей надёжности, дешевизне и простоте. В ряде стран (включая Россию) продолжают использовать прописи, разработанные в середине XX века, с незначительными модификациями (например, замена фенола на другие антисептики).

Источники

• Абрикосов А. И. «Патологическая анатомия. Часть общая и частная». — М., 1949.
• Давыдовский И. В. «Патологическая анатомия и патогенез болезней человека». — М., 1956.
• Глазунов М. Ф. «Методы консервации патологоанатомических препаратов». — Л., 1965.
• Автандилов Г. Г. «Основы патологоанатомической практики». — М., 1994.
• von Hagens G. «Plastination: A New Approach to Morphological Research». — Heidelberg, 1986.
• Инструкция по консервации патологоанатомических препаратов (утверждена Минздравом СССР, 1970-е гг.).