FISH

FISH (от англ. _fluorescence in situ hybridization_, флуоресцентная гибридизация _in situ_) — это цитогенетический метод, использующий флуоресцентно меченные ДНК-зонды для обнаружения и определения положения специфических последовательностей нуклеотидов на хромосомах, в интерфазных ядрах клеток, а также на препаратах тканей. Метод позволяет визуализировать наличие, количество и локализацию конкретных генов, хромосомных участков или целых хромосом непосредственно в клетке, сохраняя её морфологию.

История

Метод FISH стал развитием более раннего метода гибридизации _in situ_ (ISH), в котором использовались радиоактивно меченные зонды. Первые эксперименты по гибридизации нуклеиновых кислот непосредственно на хромосомных препаратах были проведены в конце 1960-х годов Джозефом Гэллом и Мэри-Лу Пардью. Однако низкая чувствительность и необходимость работы с радиоактивными изотопами (тритий) ограничивали применение метода.

Ключевой прорыв произошёл в начале 1980-х годов с разработкой нерадиоактивных методов мечения. В 1982 году группа под руководством Дэвида Уорда (Йельский университет) впервые применила биотинилированные зонды, которые выявлялись с помощью флуоресцентно меченного авидина. Это позволило отказаться от радиоактивности и значительно повысить разрешение метода. В 1986 году та же группа предложила использовать флуоресцентные красители (флуорохромы) непосредственно для мечения зондов, что дало название методу — FISH. В 1990-е годы были разработаны методы мультиплексного FISH, позволяющие одновременно анализировать несколько мишеней с использованием разных флуорохромов, и спектральное кариотипирование (SKY).

Принцип метода

Метод FISH основан на способности одноцепочечной ДНК (зонда) образовывать стабильную двухцепочечную структуру (гибридизоваться) с комплементарной ей последовательностью ДНК в образце. Процесс включает несколько этапов:

1. Подготовка образца: Клетки или ткань фиксируются (обычно на предметном стекле), чтобы сохранить их структуру. ДНК в ядрах денатурируется (превращается в одноцепочечную форму) с помощью нагревания или обработки щелочью.
2. Приготовление зонда: Синтезируется или выделяется ДНК-зонд, комплементарный целевой последовательности. Зонд метится флуоресцентным красителем (например, FITC — зелёный, Cy3 — красный, Cy5 — дальний красный) или гаптеном (биотин, дигоксигенин), который затем выявляется флуоресцентно меченным антителом.
3. Гибридизация: Денатурированный зонд наносится на препарат и инкубируется при определённой температуре (обычно 37–42 °C) в течение нескольких часов или ночи. Зонд связывается с комплементарной последовательностью ДНК в образце.
4. Отмывка: Несвязавшийся зонд удаляется промывками в буферных растворах с различной концентрацией солей и при разных температурах. Строгость отмывки определяет специфичность гибридизации.
5. Детекция: Если зонд был помечен гаптеном, на препарат наносятся флуоресцентно меченные антитела. Для визуализации сигнала используется флуоресцентный микроскоп с набором светофильтров, соответствующих спектрам возбуждения и эмиссии используемых красителей. Ядра клеток часто контрастно окрашивают DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол), который связывается с ДНК и даёт голубое свечение.

Типы зондов

Выбор типа зонда определяется задачей исследования:

• Локус-специфичные зонды: Комплементарны уникальным последовательностям длиной от нескольких сотен до нескольких тысяч пар оснований. Используются для выявления делеций, дупликаций, транслокаций или амплификации конкретных генов (например, гена _HER2/neu_ при раке молочной железы).
• Центромерные (альфоидные) зонды: Комплементарны повторяющимся последовательностям ДНК в центромерных регионах хромосом. Позволяют идентифицировать конкретные хромосомы и подсчитывать их количество в ядре (анэуплоидии, например, трисомия 21 — синдром Дауна).
• Хромосом-специфичные «пейнты» (whole chromosome painting probes): Смесь зондов, комплементарных последовательностям, распределённым по всей длине одной конкретной хромосомы. Используются для анализа сложных хромосомных перестроек и идентификации маркерных хромосом.
• Теломерные зонды: Комплементарны последовательностям на концах хромосом (теломерам). Применяются для выявления скрытых делеций или транслокаций, затрагивающих концы хромосом.

Применение

Метод FISH широко используется в медицине, биологии и генетике.

Клиническая генетика

• Пренатальная диагностика: Быстрое выявление численных хромосомных аномалий (анэуплоидий) у плода по клеткам амниотической жидкости или ворсинам хориона. FISH позволяет получить результат в течение 24–48 часов, в отличие от классического кариотипирования, требующего культивирования клеток.
• Постнатальная диагностика: Уточнение результатов кариотипирования, выявление микроделеций и микродупликаций (например, синдром Ди Джорджи — делеция 22q11.2), определение пола и выявление мозаицизма.
• Онкогенетика: Выявление специфических хромосомных транслокаций, характерных для определённых видов рака (например, транслокация t(9;22) — филадельфийская хромосома при хроническом миелоидном лейкозе; транслокация t(8;14) при лимфоме Беркитта). Определение статуса амплификации гена _HER2/neu_ при раке молочной железы и желудка, что влияет на выбор таргетной терапии (трастузумабом).

Молекулярная биология и цитогенетика

• Картирование генов: Определение порядка и относительного положения генов на хромосоме.
• Изучение структуры хроматина: Анализ трёхмерной организации генома в интерфазном ядре, выявление взаимодействий между удалёнными участками ДНК.
• Анализ клеточного цикла: Изучение репликации ДНК и сегрегации хромосом.

Микробиология и экология

• Идентификация микроорганизмов: FISH с зондами на рибосомальную РНК (16S рРНК) позволяет идентифицировать и визуализировать бактерии, археи и простейших непосредственно в образцах окружающей среды (почва, вода, биоплёнки) или клинических образцах без необходимости культивирования.

Преимущества и ограничения

Преимущества:

• Высокая чувствительность и специфичность.
• Возможность анализа на уровне единичных клеток.
• Сохранение морфологии клеток и тканей.
• Быстрота получения результата (от нескольких часов до 1–2 дней).
• Возможность мультиплексного анализа (одновременная детекция нескольких мишеней).

Ограничения:

• Необходимость знания последовательности ДНК-мишени для синтеза зонда.
• Невозможность выявления неизвестных или новых хромосомных аномалий (в отличие от классического кариотипирования или хромосомного микроматричного анализа).
• Требуется дорогостоящее оборудование (флуоресцентный микроскоп с высоким разрешением) и квалифицированный персонал.
• Возможны артефакты, связанные с неспецифическим связыванием зонда или плохим качеством препарата.

Современные модификации

Разработаны многочисленные варианты метода FISH, расширяющие его возможности:

• M-FISH (мультиплексный FISH): Одновременное использование 24 разных зондов, каждый из которых мечен уникальной комбинацией флуорохромов, для окрашивания всех хромосом человека в разные цвета. Позволяет выявлять сложные межхромосомные перестройки.
• SKY (спектральное кариотипирование): Анализ спектра испускаемого света с помощью интерферометра, что позволяет различать больше флуорохромов, чем при обычной фильтровой микроскопии.
• CGH (сравнительная геномная гибридизация): Метод, при котором ДНК пациента и контрольная ДНК, меченные разными флуорохромами, одновременно гибридизуются на нормальные метафазные хромосомы. Позволяет выявлять дисбаланс числа копий ДНК (делеции и дупликации) по всему геному.
• Fiber-FISH: Гибридизация на растянутые молекулы ДНК (хроматиновые волокна), что обеспечивает очень высокое разрешение (до 1–2 тысяч пар оснований) и позволяет картировать близко расположенные гены.
• RNA-FISH: Использование зондов, комплементарных РНК, для визуализации экспрессии генов и локализации мРНК в цитоплазме клеток.

Источники

1. Trask, B. J. (2002). Human cytogenetics: 46 chromosomes, 46 years and counting. Nature Reviews Genetics, 3(10), 769-778.
2. Speicher, M. R., & Carter, N. P. (2005). The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nature Reviews Genetics, 6(10), 782-792.
3. Pinkel, D., & Albertson, D. G. (2005). Array comparative genomic hybridization and its applications in cancer. Nature Genetics, 37(6s), S11-S17.
4. Bishop, R. (2010). Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons, 3(1), 85-95.
5. Volpi, E. V., & Bridger, J. M. (2008). FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique. BioTechniques, 45(4), 385-409.