Иммуноблотинг — метод лабораторной диагностики¶
Иммуноблотинг (англ. immunoblotting, Western blot) — лабораторный метод анализа белков, основанный на разделении смеси белков по молекулярной массе с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), переносе (блоттинге) разделённых белков на мембранный носитель и последующем обнаружении целевого белка с помощью специфических антител. Метод сочетает высокую разделяющую способность электрофореза и высокую специфичность иммунного распознавания, что позволяет идентифицировать отдельные белки в сложных биологических смесях.
¶Принцип метода
Иммуноблотинг включает несколько последовательных этапов:
- Электрофорез. Белковую смесь разделяют в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS), который денатурирует белки и придаёт им отрицательный заряд, пропорциональный массе. В результате белки мигрируют по гелю со скоростью, обратно зависимой от логарифма их молекулярной массы.
- Блоттинг. Разделённые белки переносят с геля на твёрдый носитель — нитроцеллюлозную или поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану — с помощью электрического поля (электроблоттинг) или капиллярного переноса. Перенос обеспечивает доступность белков для последующих иммунологических реакций.
- Блокирование. Мембрану обрабатывают раствором «блокирующего» белка (обычно бычьим сывороточным альбумином или обезжиренным молоком), чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител с носителем.
- Инкубация с первичными антителами. Мембрану инкубируют с антителами, специфичными к целевому белку. Антитела связываются с соответствующим эпитопом на поверхности мембраны.
- Инкубация со вторичными антителами. Вторичные антитела, распознающие константную область первичных антител и помеченные меткой (ферментом, чаще щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена, либо флуорохромом), связываются с первичными.
- Детекция. Метку обнаруживают с помощью хемилюминесцентной, хромогенной или флуоресцентной реакции. Результат фиксируют на рентгеновской плёнке или считывают с помощью сканера. Целевой белок проявляется в виде полосы на определённой высоте, соответствующей его молекулярной массе.
¶Виды иммуноблотинга
Помимо классического варианта (Western blot), выделяют:
- Саузерн-блоттинг (Southern blot) — обнаружение определённых последовательностей ДНК после электрофоретического разделения и переноса на мембрану;
- Нортерн-блоттинг (Northern blot) — анализ РНК по аналогичной схеме;
- Дот-блоттинг (dot blot) — упрощённый вариант, при котором пробу наносят на мембрану точкой без предварительного электрофоретического разделения.
Все эти методы объединяют принцип «разделение — перенос — гибридизация/иммунное распознавание».
¶Применение
¶Диагностика инфекционных заболеваний
Иммуноблотинг широко применяется для подтверждения результатов скрининговых тестов. Классическим примером является подтверждающий тест на ВИЧ-инфекцию: при положительном результате ИФА (ELISA) проводят иммуноблотинг с использованием набора рекомбинантных антигенов вируса (gp41, gp120, gp160, p24, p31 и др.). Обнаружение антител к двум и более антигенам из набора расценивается как положительный результат. Аналогичная схема используется при диагностике боррелиоза (болезни Лайма) — иммуноблотинг применяют для подтверждения скрининговых результатов, выявляя антитела к антигенам Borrelia burgdorferi.
¶Исследовательская работа
В молекулярной биологии и биохимии иммуноблотинг служит основным методом:
- контроля экспрессии белков в клеточных линиях и тканях;
- изучения посттрансляционных модификаций (фосфорилирование, гликозилирование, убиквитинирование);
- анализа взаимодействий белков (в сочетании с иммунопреципитацией — co-IP);
- определения уровня белка в пробах.
¶Медицинская диагностика
Иммуноблотинг применяют при подозрении на аутоиммунные заболевания (выявление аутоантител, например при системной красной волчанке — антитела к двуспиральной ДНК), при диагностике аллергии (выявление аллерген-специфических IgE) и в некоторых других областях.
¶Преимущества и ограничения
К достоинствам метода относятся высокая специфичность, возможность одновременного определения молекулярной массы белка, относительно небольшое количество пробы. Ограничения — трудоёмкость, длительность процедуры (несколько часов — до суток), необходимость использования больших объёмов первичных антител, а также полуколичественный характер результата. В клинической лабораторной практике во многих случаях иммуноблотинг постепенно вытесняется более высокопроизводительными методами — хемилюминесцентным иммуноанализом (CLIA) и масс-спектрометрией.
¶История
Термин «блоттинг» был предложен в 1975 году Edwin Southern для описания метода переноса ДНК с геля на мембрану. Впоследствии аналогичные методы были разработаны для РНК (Northern blot, 1977, Томасом Шарпом) и белков (Western blot, 1979–1981; названия «Northern» и «Western» — каламбур по отношению к «Southern»). Авторство термина «Western blot» приписывают Neal Burnette. Метод быстро стал стандартом в иммунологии и молекулярной биологии.
¶Источники
- «Molecular Cloning: A Laboratory Manual» (J. Sambrook, D.W. Russell)
- «Current Protocols in Immunology» (Wiley)
- «Лабораторные методы исследования в клинической медицине» (пер. с англ.)
- Научные обзоры в журналах «Journal of Immunological Methods», «Nature Protocols»