Каллусная ткань

Каллусная ткань (от лат. callus — мозоль, толстая кожа) — это неспециализированная паренхиматозная ткань, образующаяся у растений в местах повреждений, а также в культуре in vitro на питательных средах. Представляет собой массу дедифференцированных клеток, способных к активному делению и последующей регенерации целого растения или его органов. Каллусная ткань играет ключевую роль в процессах заживления ран у растений и является основным объектом биотехнологических исследований, в том числе для микроклонального размножения, получения вторичных метаболитов и генетической трансформации.

Образование и структура

Природное образование

В естественных условиях каллусная ткань формируется в ответ на механические повреждения (порезы, ожоги, укусы насекомых), инфекции или воздействие фитогормонов. Процесс начинается с деления живых клеток, расположенных рядом с раневой поверхностью, — чаще всего клеток камбия, перицикла или сердцевинных лучей. В результате образуется рыхлая масса паренхимных клеток, которая заполняет рану и защищает внутренние ткани от проникновения патогенов и потери влаги.

Клетки каллуса в природе обычно крупные, тонкостенные, с крупным ядром и многочисленными вакуолями. Они не имеют чёткой пространственной организации, хотя в некоторых случаях могут образовывать слои или тяжи. Со временем часть клеток каллуса может дифференцироваться в проводящие или механические ткани, что способствует восстановлению целостности органа.

Индукция in vitro

В лабораторных условиях каллусную ткань получают путём культивирования эксплантов (фрагментов растений — стеблей, листьев, корней, семядолей, пыльников) на искусственных питательных средах, содержащих необходимые макро- и микроэлементы, витамины, сахара и фитогормоны. Ключевую роль в индукции каллусогенеза играют ауксины (например, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, индолил-3-уксусная кислота, нафтилуксусная кислота) и цитокинины (например, кинетин, 6-бензиламинопурин). Соотношение этих гормонов определяет, будет ли эксплант образовывать каллус, корни или побеги.

Процесс обычно занимает от нескольких дней до нескольких недель, в зависимости от вида растения, типа экспланта и состава среды. Первичный каллус может быть рыхлым, плотным, водянистым или зернистым, а его цвет варьируется от белого и жёлтого до зелёного, красного или коричневого (в зависимости от накопления пигментов, например, антоцианов или каротиноидов).

Классификация и типы каллусных тканей

Каллусные ткани классифицируют по нескольким признакам:

По происхождению

• Первичный каллус — образуется непосредственно на экспланте в первые недели культивирования.
• Вторичный (субкультивируемый) каллус — получают после переноса (пассажа) первичного каллуса на свежую питательную среду. Такие культуры могут поддерживаться годами.

По морфологии

• Рыхлый (эмбриогенный) — состоит из мелких, изодиаметрических клеток с плотной цитоплазмой, часто способен к соматическому эмбриогенезу.
• Плотный (неэмбриогенный) — образован крупными, вакуолизированными клетками, часто с толстыми клеточными стенками; регенерационная способность обычно низкая.

По способности к регенерации

• Органогенный каллус — способен формировать адвентивные почки или корни при изменении гормонального баланса.
• Эмбриогенный каллус — образует соматические зародыши, которые могут развиваться в полноценные растения.
• Неорганизованный (недифференцированный) — не проявляет морфогенетической активности.

Применение

Микроклональное размножение

Каллусная культура используется для массового получения генетически однородных растений. Из каллуса индуцируют образование побегов или соматических зародышей, которые затем укореняют и переносят в почву. Этот метод особенно важен для редких, исчезающих или трудно размножаемых видов, а также для получения безвирусного посадочного материала (например, у картофеля, земляники, гвоздики).

Получение вторичных метаболитов

Многие растения синтезируют ценные биологически активные вещества (алкалоиды, гликозиды, флавоноиды, терпеноиды), которые можно получать в культуре каллусных клеток. Клеточные суспензии, полученные из каллуса, выращивают в биореакторах, что позволяет нарабатывать целевые продукты (например, таксол из тиса, женьшенезиды из женьшеня, шиконин из воробейника) в контролируемых условиях, независимо от климата и почвы.

Генетическая трансформация

Каллусная ткань является удобной мишенью для введения чужеродных генов. Трансформацию проводят с помощью Agrobacterium tumefaciens или биобаллистического метода. Из трансформированных каллусных клеток затем регенерируют растения с новыми свойствами (устойчивость к гербицидам, вредителям, засухе; улучшенный состав масла или крахмала).

Сохранение редких видов

Каллусные культуры позволяют долговременно хранить генофонд редких и исчезающих растений. Образцы каллуса можно криоконсервировать (замораживать при температуре жидкого азота) и при необходимости размораживать для регенерации растений.

Фундаментальные исследования

Каллусная ткань служит моделью для изучения клеточного деления, дифференцировки, метаболизма, действия фитогормонов, а также механизмов устойчивости к стрессам и патогенам.

Факторы, влияющие на каллусогенез

Успешное образование и рост каллусной ткани зависят от ряда факторов:

• Генотип растения — разные виды и даже сорта одного вида могут значительно различаться по способности к каллусогенезу.
• Тип экспланта — молодые, активно делящиеся ткани (меристемы, молодые листья, незрелые зародыши) обычно дают лучший результат.
• Состав питательной среды — концентрация и соотношение ауксинов и цитокининов, а также наличие витаминов (тиамин, пиридоксин) и аминокислот (глутамин, аспарагин).
• Условия культивирования — температура (обычно 22–28 °C), освещение (многие каллусы лучше растут в темноте или при низкой освещённости), влажность и газовый состав.
• Стерильность — каллусные культуры очень чувствительны к бактериальному и грибному загрязнению, поэтому все манипуляции проводят в асептических условиях.

Ограничения и проблемы

Несмотря на широкое применение, работа с каллусными тканями сопряжена с рядом трудностей:

• Соматическое клональное варьирование — при длительном культивировании в клетках могут накапливаться мутации, что приводит к генетической неоднородности и потере регенерационной способности.
• Витрификация — избыточное увлажнение и нарушение газообмена могут вызывать стекловидность (гипергидратацию) тканей, что делает их непригодными для регенерации.
• Фенольное окисление — у многих древесных и травянистых растений при повреждении выделяются фенольные соединения, которые окисляются и токсичны для клеток; для подавления этого процесса в среды добавляют антиоксиданты (поливинилпирролидон, активированный уголь).
• Потеря морфогенетического потенциала — со временем каллусные линии могут утрачивать способность к образованию побегов или зародышей, что требует оптимизации условий культивирования или использования свежих эксплантов.

История изучения

Первые наблюдения каллусообразования у растений относятся к XVIII–XIX векам, когда ботаники описывали заживление ран у деревьев. В начале XX века немецкий ботаник Готлиб Габерландт высказал идею о тотипотентности растительных клеток — способности любой живой клетки дать начало целому организму. В 1930-х годах Роже Готье и Филип Уайт независимо разработали методы культивирования растительных тканей на искусственных средах, что стало основой для получения каллусных культур. В 1950-х годах Фредерик Стюарт и его коллеги впервые продемонстрировали соматический эмбриогенез из каллусных клеток моркови, подтвердив тотипотентность. С тех пор каллусные культуры стали рутинным инструментом в биотехнологии растений.

Источники

• Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. — М.: ФБК (организация признана экстремистской, деятельность запрещена в РФ)-Пресс, 1999.
• Гамбург К. З., Рекубратская Н. И. Культура тканей и клеток растений. — Новосибирск: Наука, 1986.
• Лутова Л. А., Проворов Н. А., Тиходеев О. Н. и др. Генетика развития растений. — СПб.: Наука, 2000.
• Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum. — 1962. — Vol. 15, № 3. — P. 473–497.
• George E. F., Hall M. A., De Klerk G.-J. Plant Propagation by Tissue Culture. — 3rd ed. — Springer, 2008.