Крис-П

Крис-П (англ. CRISPR, от Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats — кластеризованные регулярно расположенные короткие палиндромные повторы) — это система адаптивного иммунитета бактерий и архей, а также основанная на ней технология редактирования геномов, позволяющая вносить направленные изменения в последовательности ДНК живых организмов. В основе метода лежит использование комплекса из направляющей РНК и нуклеазы (чаще всего Cas9), который распознаёт и разрезает целевой участок ДНК.

История открытия

Первые наблюдения необычных повторяющихся последовательностей в геноме бактерии Escherichia coli были сделаны в 1987 году японскими учёными под руководством Ёсидзуми Исино. Однако природа этих структур оставалась неясной. В 2002 году группа нидерландских исследователей во главе с Рудом Янсеном ввела термин CRISPR и выявила гены, ассоциированные с этой системой (cas-гены).

В 2005 году сразу три независимые группы (Филиппа Хорвата, Александра Болотина и Франсиско Мохики) обнаружили, что спейсеры CRISPR-локусов гомологичны фрагментам ДНК вирусов-бактериофагов и плазмид. Это привело к гипотезе, что CRISPR является формой приобретённого иммунитета у прокариот.

В 2007 году группа Родольфа Баррангу из компании Danisco экспериментально подтвердила, что именно CRISPR-Cas-система обеспечивает защиту бактерий от вирусов. В 2008 году команда Эрика Сонтхаймера и Люсьена Марра показала, что молекулы РНК, транскрибируемые с CRISPR-локусов (crРНК), направляют нуклеазу Cas на уничтожение чужеродной ДНК.

Ключевой прорыв произошёл в 2012 году, когда группа Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Даудна продемонстрировала, что систему CRISPR-Cas9 можно перепрограммировать для разрезания любой заданной последовательности ДНК in vitro. В 2013 году коллектив Фэна Чжана впервые применил CRISPR-Cas9 для редактирования генома клеток человека и мыши. За открытие и разработку технологии CRISPR-Cas9 Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Даудна были удостоены Нобелевской премии по химии в 2020 году.

Механизм действия

Естественная система иммунитета

В природе CRISPR-Cas-системы функционируют в три этапа:

1. Адаптация (захват спейсеров). При проникновении вируса бактерия встраивает короткий фрагмент его ДНК (протоспейсер) в свой CRISPR-локус. Этот фрагмент становится новым спейсером, расположенным между палиндромными повторами.
2. Экспрессия (синтез РНК). CRISPR-локус транскрибируется в длинную пре-крРНК, которая затем нарезается на короткие зрелые crРНК, каждая из которых содержит один спейсер.
3. Интерференция (уничтожение мишени). crРНК связывается с белком Cas (например, Cas9) и направляет его к комплементарной последовательности ДНК вируса. Белок Cas распознаёт короткий мотив PAM (протоспейсер-ассоциированный мотив), расположенный рядом с целевым участком, и вносит двуцепочечный разрыв в ДНК. Это приводит к гибели вируса или инактивации плазмиды.

Технология редактирования

Для искусственного редактирования генома используется упрощённая система, состоящая из двух компонентов:

• Белок Cas9 (или его модификации) — эндонуклеаза, способная разрезать ДНК.
• Направляющая РНК (sgРНК) — синтетическая молекула, объединяющая функции crРНК и tracrРНК (вспомогательной РНК, необходимой для созревания crРНК). sgРНК содержит последовательность длиной около 20 нуклеотидов, комплементарную целевому участку генома.

После внесения двуцепочечного разрыва клетка активирует один из двух механизмов репарации:

1. Негомологичное соединение концов (NHEJ). Основной путь репарации, который часто приводит к вставкам или делециям (инделы) в месте разрыва. Это может нарушить рамку считывания гена, что используется для его «выключения» (нокаут гена).
2. Гомологичная репарация (HDR). Если в клетку дополнительно ввести донорную ДНК-матрицу, содержащую нужную последовательность, то клетка может использовать её для восстановления разрыва. Это позволяет вставить в геном новый ген или скорректировать существующую мутацию.

Классификация систем CRISPR-Cas

Системы CRISPR-Cas подразделяются на два класса, шесть типов и множество подтипов:

• Класс 1 (типы I, III, IV): используют комплексы из нескольких белков Cas для разрезания ДНК/РНК.
• Класс 2 (типы II, V, VI): используют один эффекторный белок. Именно белки класса 2 (Cas9, Cas12, Cas13) получили наибольшее распространение в генной инженерии благодаря простоте использования.

Наиболее изучен и широко применяется белок Cas9 из системы II типа Streptococcus pyogenes (SpCas9). Позднее были открыты и адаптированы другие нуклеазы, такие как Cas12 (разрезает ДНК, оставляя липкие концы) и Cas13 (нацелена на РНК).

Применение

Фундаментальные исследования

CRISPR-технология произвела революцию в молекулярной биологии, позволив быстро и точно создавать генетически модифицированные клеточные линии и модельные организмы (мыши, рыбы, дрозофилы, растения). Это ускорило изучение функций генов, механизмов развития и патогенеза заболеваний.

Сельское хозяйство

С помощью CRISPR создаются сорта растений с улучшенными свойствами: устойчивостью к засухе, вредителям и болезням, повышенной урожайностью, улучшенным питательным составом. Примеры включают грибы, не темнеющие на срезе, сою с изменённым жирнокислотным составом, помидоры с повышенным содержанием гамма-аминомасляной кислоты (GABA). В России в 2023 году были зарегистрированы первые сорта картофеля, полученные с помощью CRISPR-технологии.

Медицина и биотехнология

• Генная терапия. Разрабатываются методы лечения наследственных заболеваний (серповидноклеточная анемия, бета-талассемия, муковисцидоз, мышечная дистрофия Дюшенна). В 2023 году в Великобритании и США была одобрена терапия Casgevy (на основе CRISPR-Cas9) для лечения серповидноклеточной анемии и бета-талассемии.
• Онкология. Создаются CAR-T-клетки с улучшенными свойствами, а также исследуются подходы к редактированию генов опухолевых клеток.
• Диагностика. Системы на основе Cas12 и Cas13 (например, SHERLOCK, DETECTR) позволяют быстро и с высокой чувствительностью выявлять ДНК или РНК патогенов, включая вирусы (SARS-CoV-2, ВИЧ) и бактерии.
• Промышленная биотехнология. CRISPR используется для оптимизации штаммов микроорганизмов, производящих ферменты, биотопливо, аминокислоты и другие ценные соединения.

Драйв генов (Gene Drive)

Технология, позволяющая ускорить распространение определённого генетического признака в популяции. Рассматривается как потенциальный инструмент для борьбы с малярийными комарами (подавление их способности переносить малярийный плазмодий) или инвазивными видами. Применение драйва генов вызывает серьёзные этические опасения и пока ограничено лабораторными исследованиями.

Этические и правовые аспекты

Редактирование генома человека

Наибольшие споры вызывает применение CRISPR к зародышевым клеткам человека (сперматозоиды, яйцеклетки, эмбрионы), так как изменения в них наследуются будущими поколениями. В 2018 году китайский учёный Хэ Цзянькуй объявил о рождении первых генетически модифицированных детей (близнецов с отредактированным геном CCR5, что должно было обеспечить устойчивость к ВИЧ). Этот эксперимент был осуждён мировым научным сообществом как безответственный и неэтичный, а сам учёный был приговорён к тюремному заключению.

В большинстве стран мира, включая Россию, редактирование генома эмбрионов человека с целью имплантации законодательно запрещено. Допускаются лишь фундаментальные исследования на эмбрионах на ранних стадиях развития (не более 14 дней) при условии их последующего уничтожения.

Интеллектуальная собственность

Вопрос патентования технологии CRISPR-Cas9 стал предметом ожесточённого юридического спора между группами Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Даудна (Университет Калифорнии, Беркли) и Фэна Чжана (Бродовский институт, Массачусетский технологический институт). Разбирательства касаются приоритета в изобретении и объёма патентных прав. В США и Европе были вынесены различные решения, признающие патенты за обеими сторонами, но с разными формулировками.

Биобезопасность

Существуют опасения, что технология CRISPR может быть использована для создания биологического оружия или для непреднамеренного нанесения вреда экосистемам (например, при неконтролируемом выпуске организмов с драйвом генов). В связи с этим разрабатываются международные нормы и правила, регулирующие исследования в области редактирования генома.

Критика и ограничения

• Внецелевые эффекты. Белок Cas9 может разрезать участки ДНК, частично гомологичные направляющей РНК, что приводит к нежелательным мутациям. Разрабатываются методы для снижения вероятности таких эффектов (использование высокоспецифичных вариантов Cas9, биоинформатический дизайн sgРНК).
• Эффективность доставки. Доставка компонентов CRISPR в нужные клетки организма (особенно в соматические клетки взрослого человека) остаётся серьёзной технической проблемой. Используются вирусные векторы (аденоассоциированные вирусы, лентивирусы), липидные наночастицы и другие системы.
• Иммунный ответ. Белки Cas бактериального происхождения могут распознаваться иммунной системой человека, вызывая воспалительную реакцию и снижая эффективность терапии.
• Мозаицизм. При редактировании эмбрионов на ранних стадиях развития изменения могут произойти не во всех клетках, что приводит к формированию организма с генетически разнородными клетками (мозаицизм).

Источники

1. Jinek, M., et al. (2012). A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337(6096), 816-821.
2. Cong, L., et al. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 339(6121), 819-823.
3. Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2014). The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science, 346(6213), 1258098.
4. Barrangou, R., & Marraffini, L. A. (2014). CRISPR-Cas systems: prokaryotes upgrade to adaptive immunity. Molecular Cell, 54(2), 234-244.
5. Ledford, H. (2015). CRISPR, the disruptor. Nature, 522(7554), 20-24.
6. Cyranoski, D. (2018). CRISPR-baby scientist fails to satisfy critics. Nature, 564(7734), 13-14.
7. Нобелевская лекция Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Даудна, 2020.
8. Федеральный закон РФ «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности» (с изменениями и дополнениями).