Масляная иммерсия¶

Масляная иммерсия — метод оптической микроскопии, при котором пространство между объективом и препаратом заполняется жидкостью с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла (около 1,515). Это позволяет увеличить разрешающую способность микроскопа и яркость изображения за счёт уменьшения потерь света на преломление и отражение.

¶Принцип действия

При наблюдении в воздушной среде (сухие объективы) световые лучи, выходящие из препарата под большим углом, преломляются на границе «покровное стекло — воздух» и не попадают в объектив. Это ограничивает числовую апертуру объектива значением менее 1,0. Масляная иммерсия устраняет эту границу: иммерсионное масло имеет показатель преломления n ≈ 1,515, что практически совпадает с показателем преломления оптического стекла (n ≈ 1,52). Лучи проходят через масло без существенного преломления, что позволяет объективу собирать свет, выходящий из препарата под большими углами.

Числовая апертура иммерсионных объективов достигает 1,25–1,45 (у масляных) и до 1,65 (у специализированных). Разрешающая способность микроскопа определяется формулой d = λ/(2·NA), где λ — длина волны света, NA — числовая апертура. Для видимого света (λ ≈ 550 нм) и NA = 1,4 разрешение составляет около 200 нм, что близко к теоретическому пределу световой микроскопии.

¶История

Первые попытки использования иммерсии относятся к XVII веку. В 1678 году Антони ван Левенгук применял воду между линзой и образцом. В 1812 году английский оптик Уильям Амичи разработал первый водно-иммерсионный объектив. Масляная иммерсия была предложена в 1847 году Джованни Баттистой Амичи (племянником Уильяма Амичи), который использовал кедровое масло. К 1870-м годам немецкие оптики (Карл Цейсс, Эрнст Аббе) усовершенствовали конструкцию иммерсионных объективов, сделав их стандартным инструментом научных лабораторий.

¶Техника применения

Процедура работы с масляной иммерсией включает несколько этапов:

• На препарат (обычно фиксированный окрашенный мазок или гистологический срез) наносится капля иммерсионного масла.
• Объектив с маркировкой «HI» (homogeneous immersion) или «Oil» осторожно опускается до контакта с каплей.
• Фокусировка производится только на малом увеличении, затем поворотом револьверной головки устанавливается иммерсионный объектив.
• После работы масло удаляется с объектива мягкой тканью или салфеткой, смоченной в растворителе (ксилол или специальный очиститель).

¶Иммерсионные жидкости

Классическое иммерсионное масло производится на основе кедрового масла, однако современные составы представляют собой синтетические смеси (например, полифениловые эфиры) с контролируемыми оптическими характеристиками. Требования к иммерсионным жидкостям:

• показатель преломления 1,515 ± 0,001;
• отсутствие флуоресценции;
• химическая инертность по отношению к препарату и оптике;
• стабильность вязкости в рабочем диапазоне температур.

Существуют также водная иммерсия (n = 1,33) и глицериновая (n = 1,47), применяемые для живых клеток и флуоресцентной микроскопии, где масло может искажать сигнал.

¶Применение

Масляная иммерсия используется в следующих областях:

• Микробиология — стандартный метод идентификации бактерий по морфологии (окраска по Граму, Цилю — Нильсену).
• Гематология — дифференцировка клеток крови в мазках.
• Гистология — детальное изучение тонких срезов тканей.
• Цитология — исследование клеточных структур (хромосом, ядрышек).
• Материаловедение — металлография для анализа микроструктуры сплавов.

В клинической лабораторной диагностике масляная иммерсия обязательна при микроскопии мазков крови для подсчёта лейкоцитарной формулы, а также при выявлении микобактерий туберкулёза.

¶Ограничения

Масляная иммерсия неприменима для живых нефиксированных объектов, так как масло проникает в препарат и повреждает клетки. Глубина резкости при NA = 1,4 составляет менее 0,5 мкм, что требует точной фокусировки. Работа с иммерсией возможна только на малых увеличениях (объективы 60×–100×), поскольку на больших увеличениях рабочее расстояние становится слишком малым. Также требуется тщательный уход за оптикой: остатки масла на линзах приводят к ухудшению качества изображения.

¶Источники

• Кузнецов А. В. «Оптическая микроскопия: теория и практика». — М.: Наука, 2019.
• Бартоломью Дж. «Микроскопия в биологических исследованиях». — СПб.: Питер, 2017.
• ГОСТ Р ИСО 8036-1-2019 «Оптика и фотоника. Микроскопы. Иммерсионные жидкости».