Пептидо-нуклеиновые кислоты

Пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК, англ. Peptide Nucleic Acid, PNA) — это синтетические полимеры, структурно и функционально напоминающие нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК), но с принципиально иным строением основной цепи. В отличие от природных нуклеиновых кислот, у ПНК сахарофосфатный остов заменён на псевдопептидный (полиамидный) каркас, состоящий из повторяющихся звеньев N-(2-аминоэтил)глицина. К этому остову через метиленкарбонильные линкеры присоединены азотистые основания (аденин, гуанин, цитозин, тимин), которые способны образовывать комплементарные водородные связи с основаниями ДНК и РНК. Благодаря этому свойству ПНК могут специфично связываться с целевыми последовательностями нуклеиновых кислот, что делает их перспективным инструментом в молекулярной биологии, диагностике и генной терапии.

История

Концепция создания искусственных аналогов нуклеиновых кислот с необычным остовом возникла в конце 1980-х годов. В 1991 году группа датских учёных под руководством Питера Нильсена (Peter Nielsen) из Копенгагенского университета, а также Майкла Эгхольма (Michael Egholm) и Оле Буххардта (Ole Buchardt) впервые синтезировала и описала пептидо-нуклеиновые кислоты. Исследователи заменили дезоксирибозофосфатный остов ДНК на полиамидный, состоящий из мономеров N-(2-аминоэтил)глицина. Полученные молекулы продемонстрировали способность к комплементарному связыванию с ДНК и РНК, причём с более высокой аффинностью и термостабильностью, чем у природных нуклеиновых кислот. Это открытие положило начало активному изучению ПНК в качестве зондов для гибридизации, антисмысловых агентов и инструментов для генной инженерии.

В 1990-е годы были разработаны методы твёрдофазного синтеза ПНК, аналогичные синтезу пептидов, что позволило получать олигомеры заданной длины и последовательности. К началу 2000-х годов ПНК нашли применение в диагностике инфекционных заболеваний, генетическом анализе и исследованиях по регуляции экспрессии генов. В 2010-х годах интерес к ПНК возрос в связи с развитием технологий редактирования генома и создания искусственных генетических систем.

Строение и химические свойства

Отличия от ДНК и РНК

Основное структурное отличие ПНК от природных нуклеиновых кислот — отсутствие сахарофосфатного остова. В природных ДНК и РНК сахар (дезоксирибоза или рибоза) соединяется с фосфатными группами, образуя отрицательно заряженную цепь. В ПНК этот остов заменён на нейтральный полиамидный каркас, состоящий из повторяющихся звеньев N-(2-аминоэтил)глицина. Азотистые основания присоединяются к этому каркасу через метиленкарбонильные линкеры, которые имитируют длину и гибкость природных связей.

Химический состав

Мономер ПНК состоит из трёх частей:

• Аминоэтилглициновый остов — содержит амидные связи, аналогичные пептидным связям в белках.
• Метиленкарбонильный линкер — соединяет остов с азотистым основанием.
• Азотистое основание — одно из четырёх стандартных оснований (аденин, гуанин, цитозин, тимин), которые могут образовывать комплементарные пары с основаниями ДНК и РНК.

Физико-химические свойства

• Электронейтральность: отсутствие отрицательного заряда на остове делает ПНК менее растворимыми в воде по сравнению с ДНК, но улучшает их способность проникать через клеточные мембраны.
• Высокая термостабильность: гибриды ПНК-ДНК и ПНК-РНК имеют более высокую температуру плавления (Tm), чем соответствующие дуплексы ДНК-ДНК или ДНК-РНК, благодаря отсутствию электростатического отталкивания между цепями.
• Устойчивость к нуклеазам и протеазам: ПНК не распознаются ферментами, расщепляющими нуклеиновые кислоты (нуклеазами) и пептиды (протеазами), что обеспечивает их стабильность в биологических средах.
• Хиральность: стандартные ПНК ахиральны, однако возможен синтез хиральных производных.

Классификация

ПНК классифицируют по нескольким признакам:

По типу остова

• Стандартные ПНК — с остовом из N-(2-аминоэтил)глицина.
• Модифицированные ПНК — с изменениями в структуре остова, например, введение дополнительных метильных групп, циклических фрагментов или фосфонатных групп для улучшения растворимости или специфичности связывания.

По длине и последовательности

• Олигомерные ПНК — короткие цепи (обычно 10–30 мономеров), используемые в качестве зондов или антисмысловых агентов.
• Полимерные ПНК — более длинные цепи, редко применяемые из-за сложности синтеза.

По функциональному назначению

• Диагностические зонды — для выявления специфических последовательностей ДНК или РНК.
• Антисмысловые агенты — для подавления экспрессии генов.
• Инструменты для генной инженерии — для сайт-специфического связывания с ДНК.

Применение

Молекулярная диагностика

ПНК широко используются в качестве зондов для гибридизации в методах ПЦР, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и микрочипового анализа. Благодаря высокой специфичности и термостабильности, ПНК-зонды позволяют детектировать однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и мутации с высокой точностью. Например, ПНК-зонды применяются для выявления генетических маркеров наследственных заболеваний, онкологических мутаций и инфекционных агентов (вирусы, бактерии).

Антисмысловая терапия

ПНК могут использоваться в качестве антисмысловых олигонуклеотидов для блокирования трансляции мРНК или сплайсинга пре-мРНК. Связываясь с комплементарной последовательностью РНК, ПНК препятствуют её взаимодействию с рибосомами или сплайсосомой, что приводит к подавлению синтеза белка. В доклинических исследованиях ПНК-антисмысловые агенты показали эффективность против некоторых вирусных инфекций (например, вируса гепатита B) и онкологических заболеваний.

Генная инженерия и редактирование генома

ПНК применяются для сайт-специфического связывания с ДНК, что позволяет направлять ферменты репарации или рекомбинации к определённым участкам генома. В частности, ПНК используются в технологии «triplex-forming» (образование тройных спиралей) для индукции мутаций или коррекции генов. Также ПНК могут служить в качестве шаблонов для гомологичной рекомбинации при редактировании генома.

Исследование структуры нуклеиновых кислот

ПНК используются в качестве инструментов для изучения вторичной и третичной структуры ДНК и РНК. Их способность образовывать стабильные гибриды позволяет блокировать определённые участки нуклеиновых кислот и анализировать их функциональное значение.

Биотехнология и нанотехнология

ПНК применяются в создании биосенсоров, наночастиц и молекулярных машин. Например, ПНК-модифицированные наночастицы используются для адресной доставки лекарств или для детекции биомолекул.

Преимущества и ограничения

Преимущества

• Высокая аффинность и специфичность связывания с ДНК/РНК.
• Устойчивость к ферментативному расщеплению.
• Возможность проникновения через клеточные мембраны.
• Простота синтеза с использованием стандартных методов пептидного синтеза.

Ограничения

• Плохая растворимость в воде — особенно для длинных олигомеров.
• Сложность внутриклеточной доставки — несмотря на способность проникать через мембраны, эффективность доставки в ядро клетки может быть низкой.
• Ограниченная длина — синтез ПНК длиннее 30–40 мономеров технически сложен.
• Высокая стоимость — по сравнению с ДНК-зондами.

Интересные факты

• ПНК рассматриваются как один из возможных кандидатов на роль «первичной генетической молекулы» в гипотезе о происхождении жизни, поскольку их полиамидный остов мог образовываться в пребиотических условиях.
• В 2000 году Питер Нильсен и его коллеги предложили использовать ПНК для создания «искусственных генов» — синтетических последовательностей, способных к репликации и эволюции.
• ПНК используются в криминалистике для анализа деградированных образцов ДНК, так как они способны связываться с короткими фрагментами нуклеиновых кислот.

Критика и перспективы

Несмотря на многообещающие свойства, широкое внедрение ПНК в клиническую практику ограничено проблемами доставки и биодоступности. Разрабатываются различные стратегии преодоления этих ограничений, включая конъюгацию ПНК с клеточно-проникающими пептидами, липосомами или наночастицами. В перспективе ПНК могут стать основой для новых методов генной терапии, диагностики и создания искусственных биологических систем.

Источники

• Nielsen P. E., Egholm M., Berg R. H., Buchardt O. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide // Science. — 1991. — Vol. 254, No. 5037. — P. 1497–1500.
• Egholm M., Buchardt O., Christensen L., et al. PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson–Crick hydrogen-bonding rules // Nature. — 1993. — Vol. 365, No. 6446. — P. 566–568.
• Nielsen P. E. Peptide nucleic acids: a new dimension to peptide chemistry // Chemical Communications. — 1997. — No. 8. — P. 755–762.
• Ray A., Nordén B. Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical applications and promise for the future // FASEB Journal. — 2000. — Vol. 14, No. 9. — P. 1041–1060.
• Shakeel S., Karim S., Ali A. Peptide nucleic acid (PNA) — a review // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. — 2006. — Vol. 81, No. 6. — P. 892–899.
• Gupta A., Mishra A., Puri N. Peptide nucleic acids: advanced tools for biomedical applications // Journal of Biotechnology. — 2017. — Vol. 259. — P. 148–159.