Полноэкзомное секвенирование: диагностика наследственных болезней¶

Полноэкзомное секвенирование (whole exome sequencing, WES) — метод молекулярно-генетической диагностики, основанный на определении нуклеотидной последовательности всех кодирующих белки участков генома (экзонов), которые составляют около 1–2 % всего генома человека. Метод позволяет выявлять патогенные варианты в генах, ответственных за развитие наследственных заболеваний, и применяется в клинической практике для подтверждения или установления диагноза.

¶Принцип метода

Экзом — совокупность экзонов, участков ДНК, которые сохраняются в зрелой матричной РНК после сплайсинга и кодируют аминокислотные последовательности белков. Несмотря на малую долю в геноме, в экзоме сосредоточено около 85 % всех мутаций, ассоциированных с моногенными заболеваниями. При полноэкзомном секвенировании анализируется не весь геном, а только его кодирующая часть, что снижает стоимость и время анализа по сравнению с полногеномным секвенированием (WGS).

Технологически WES включает несколько этапов: выделение ДНК из образца (обычно крови), фрагментацию, обогащение экзонных участков с помощью гибридизационных проб, секвенирование на приборах нового поколения (NGS) и биоинформатический анализ полученных данных. Средняя глубина чтения составляет 100–150×, что обеспечивает надёжное детектирование гетерозиготных вариантов.

¶Диагностические возможности

WES позволяет выявлять однонуклеотидные варианты (миссенс-, нонсенс-мутации), небольшие инделы (вставки и делеции), а также варианты сайтов сплайсинга. Метод эффективен при:

• диагностике редких наследственных синдромов с неспецифической клинической картиной;
• гетерогенных заболеваниях, когда один фенотип может быть обусловлен мутациями в разных генах (например, эпилепсии, кардиомиопатии, нарушениях полового развития);
• поиске причины заболевания при отрицательных результатах таргетных панелей;
• уточнении диагноза у пациентов с множественными врождёнными пороками развития;
• пренатальной диагностике в сложных случаях.

Чувствительность метода для детекции миссенс- и нонсенс-вариантов достигает 95–99 %. Однако WES не позволяет выявлять крупные хромосомные перестройки, экспансии повторов, мутации в регуляторных и интронных областях, а также эпигенетические изменения. Для таких случаев применяются дополнительные методы (хромосомный микроматричный анализ, MLPA, секвенирование всего генома).

¶Клиническое применение

В клинической практике WES используется в двух основных форматах:

• Одиночное секвенирование экзома (singleton WES) — анализ образца пробанда без сравнения с родственниками;
• Трио-секвенирование (trio WES) — одновременный анализ пробанда и обоих родителей, что позволяет эффективнее интерпретировать варианты de novo и компаунд-гетерозиготные мутации.

Диагностический выход (доля случаев с установленным молекулярным диагнозом) при WES составляет в среднем 25–40 % и зависит от нозологии, возраста пациента и полноты клинических данных. При некоторых фенотипах (например, при тяжёлых ранних эпилептических энцефалопатиях) эффективность может достигать 50 %.

Результат WES интерпретируется в соответствии с международными рекомендациями Американского колледжа медицинской генетики (ACMG). Варианты классифицируются по пяти категориям: патогенные, вероятно патогенные, варианты неопределённого значения (VUS), вероятно доброкачественные и доброкачественные. В случае обнаружения VUS может потребоваться дополнительное функциональное исследование или анализ сегрегации в семье.

¶Ограничения и этические аспекты

К ограничениям метода относятся высокая стоимость (хотя она снижается), сложность интерпретации большого числа вариантов, возможность обнаружения случайных находок — патогенных вариантов в генах, не связанных с исходной причиной обращения (например, предрасположенность к онкологическим заболеваниям). В России практика сообщения случайных находок регулируется локальными этическими комитетами и клиническими рекомендациями.

WES не заменяет консультацию врача-генетика: интерпретация результатов всегда проводится в контексте клинической картины и семейного анамнеза. В РФ метод доступен в крупных федеральных центрах медицинской генетики и входит в клинические рекомендации по ряду наследственных заболеваний.

¶Перспективы

Развитие технологий секвенирования и удешевление анализа способствуют постепенному переходу к полногеномному секвенированию, которое дополняет WES данными о некодирующих областях. Тем не менее полноэкзомное секвенирование остаётся основным скрининговым методом первого выбора при подозрении на моногенную патологию благодаря оптимальному балансу стоимости, скорости и диагностической ценности.