Расщепление при полимеразной цепной реакции¶

Расщепление при ПЦР — термин, который в контексте полимеразной цепной реакции (ПЦР) чаще всего относится к стадии денатурации, то есть разделению двуцепочечной ДНК на две одноцепочечные матрицы за счёт разрыва водородных связей между комплементарными основаниями. Иногда под расщеплением понимают также расщепление (гидролиз) праймеров и нуклеотидов в ходе реакции, однако ключевым процессом, определяющим ход ПЦР, является именно термическое расщепление двойной спирали ДНК.

¶Стадии ПЦР и место расщепления

Полимеразная цепная реакция, предложенная в 1983 году американским биохимиком Кэри Маллисом, представляет собой метод амплификации (многократного копирования) определённого участка ДНК. Классический цикл ПЦР состоит из трёх температурных стадий:

Именно на первой стадии происходит термическое расщепление водородных связей между комплементарными основаниями двух цепей ДНК. При температуре около 95 °C водородные связи, удерживающие цепи вместе, разрушаются, и двойная спираль «распадается» на две независимые матрицы. Каждая из них затем служит шаблоном для синтеза новой комплементарной цепи.

¶Механизм термического расщепления ДНК

ДНК в растворе существует в виде двойной спирали, удерживаемой водородными связями между комплементарными парами оснований (аденин — тимин, гуанин — цитозин). Связь А–Т образована двумя водородными связями, связь Г–Ц — тремя, поэтому участки ДНК, богатые парами Г–Ц, требуют более высокой температуры для расщепления.

При нагреве до 94–98 °C кинетическая энергия молекул возрастает настолько, что водородные связи разрушаются, и цепи расходятся. Этот процесс обратим: при охлаждении комплементарные цепи могут снова сформировать двойную спираль (ренатурация). В ПЦР именно эта обратимость позволяет праймерам найти и связаться со своими матрицами на стадии отжига.

Для полного расщепления ДНК обычно достаточно 15–30 секунд при 94–98 °C. Слишком длительный нагрев может привести к денатурации самой термостабильной полимеразы (Taq-полимеразы), поэтому время стадии ограничивают.

¶Расщепление праймеров и нуклеотидов

Помимо термического расщепления двойной спирали, в ПЦР происходят и другие процессы, связанные с расщеплением химических связей:

• Гидролиз праймеров. Праймеры — короткие одноцепочечные олигонуклеотиды, направляющие полимеразу к нужному участку матрицы. При высоких температурах и в присутствии ионов магния (необходимого кофактора полимеразы) возможен частичный гидролиз фосфодиэфирных связей праймеров, что снижает эффективность реакции.
• Расщепление нуклеотидов. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP) — строительный материал для новой цепи — при длительном нагреве также могут подвергаться гидролизу с образованием пирофосфата и дезоксинуклеотидмонофосфата.
• Деградация матричной ДНК. В образцах с низким качеством ДНК (фрагментированными или повреждёнными молекулами) возможна деградация матрицы при высоких температурах, что уменьшает выход продукта реакции.

¶Оптимизация условий расщепления

Практическая реализация ПЦР требует подбора параметров стадии денатурации под конкретную задачу:

• Температура. Для большинства применений достаточно 94–95 °C. Для ДНК с высоким содержанием Г–Ц (например, геномных участков с GC-богатыми областями) может потребоваться 96–98 °C или добавление ДМСО, бетаина и других денатурантов.
• Время. Слишком короткая денатурация приводит к неполному расщеплению спирали и снижению выхода ампликона; слишком длинная — к деградации полимеразы и матрицы.
• Число циклов. Обычно проводят 25–35 циклов ПЦР, каждый из которых включает стадию расщепления. Число циклов подбирают так, чтобы амплификация оставалась в экспоненциальной фазе.
• Стартовый прогрев. Перед началом циклов часто проводят предварительную денатурацию при 94–98 °C в течение 2–5 минут для полного расщепления матричной ДНК.

¶Модификации ПЦР, связанные с расщеплением

Существуют разновидности ПЦР, в которых стадия расщепления играет особую роль или модифицируется:

• Вложенная ПЦР (nested PCR). Используются два последовательных раунда амплификации с разными праймерами, что повышает специфичность, но удваивает число стадий денатурации.
• Обратная транскрипционная ПЦР (ОТ-ПЦР). Перед амплификацией РНК обратной транскриптазой переводится в кДНК, после чего стандартный цикл с денатурацией применяется к этой кДНК.
• Дробная ПЦР (droplet digital PCR). Реакция разделяется на тысячи независимых объёмов, что позволяет количественно определять молекулы ДНК, но стадия расщепления остаётся принципиально той же.
• Изотермические методы (LAMP, RPA). В этих методах термическое расщепление ДНК не требуется: разделение цепей обеспечивается специальными полимеразами с хеликазной активностью или химическими агентами, а реакция идёт при постоянной температуре (60–65 °C).

¶Значение стадии расщепления

Стадия денатурации — фундаментальный элемент ПЦР, обеспечивающий доступность матричных цепей для праймеров и полимеразы. Именно от полноты и точности термического расщепления двойной спирали зависит специфичность и выход амплификации. Оптимизация этой стадии — одна из ключевых задач при разработке протоколов ПЦР для медицинской диагностики, генетического тестирования, криминалистики и молекулярной биологии.

Источники:

• Маллис К. ПЦР. — М.: Мир, 1993.
• Лаврик О. И., Фаворов В. В. Полимеразная цепная реакция. — Новосибирск: Наука, 1994.
• Innis M. A., Gelfand D. H., Sninsky J. J. PCR Applications: Protocols for Optimizing Reactions. — Academic Press, 1999.
• Справочник по молекулярной биологии и генной инженерии / под ред. А. А. Баялиева. — М.: БИНОМ, 2012.