Ультрацентрифуга

Ультрацентрифуга — это прибор для разделения, осаждения и фракционирования частиц или молекул в жидкой среде под действием центробежной силы, создаваемой при вращении ротора с очень высокой скоростью (обычно свыше 20 000 об/мин, вплоть до 150 000 об/мин и более). Ультрацентрифуги используются в биохимии, молекулярной биологии, медицине, химии и фармацевтике для таких задач, как выделение вирусов, клеточных органелл, белков, нуклеиновых кислот, а также для определения молекулярной массы и чистоты препаратов. В отличие от обычных центрифуг, ультрацентрифуги работают в вакууме или в среде с низким давлением для уменьшения нагрева от трения о воздух и оснащены системами охлаждения.

История

Ранние разработки

Первые центрифуги, способные развивать скорости, достаточные для осаждения коллоидных частиц, были созданы в начале XX века. В 1923 году шведский химик Теодор Сведберг (Теодор Сведберг, впоследствии лауреат Нобелевской премии по химии 1926 года) сконструировал первую ультрацентрифугу. Его аппарат позволял достигать скорости до 40 000 об/мин и создавать центробежное ускорение, в сотни тысяч раз превышающее ускорение свободного падения. Сведберг использовал ультрацентрифугу для изучения белков и коллоидных систем, что позволило впервые определить молекулярную массу гемоглобина и других макромолекул.

Развитие в XX веке

В 1930-х годах ультрацентрифуги стали применяться в биологических исследованиях, в частности для выделения вирусов (например, вируса табачной мозаики). В 1940-х годах, с развитием ядерной физики, ультрацентрифуги использовались для разделения изотопов урана, однако впоследствии этот метод был вытеснен газодиффузионным и лазерным разделением. В 1950–1960-х годах, с появлением электронной микроскопии и биохимических методов, ультрацентрифуги стали стандартным инструментом в лабораториях. В СССР серийное производство ультрацентрифуг началось в 1960-х годах на предприятиях Министерства медицинской промышленности, в частности на заводе «Центрифуга» в городе Фрунзе (ныне Бишкек, Киргизия).

Современный этап

С конца XX века ультрацентрифуги стали компактнее, надёжнее и оснащаются цифровыми системами управления. Современные модели, такие как ультрацентрифуги серии Optima (производство Beckman Coulter, США) или Sorvall (Thermo Fisher Scientific, США), способны развивать скорость до 150 000 об/мин и создавать центробежное ускорение до 1 000 000 g. В России ультрацентрифуги производятся, в частности, на предприятии «Авангард» (Санкт-Петербург) и входят в оснащение научных центров, таких как Институт биоорганической химии РАН и Институт молекулярной биологии РАН.

Устройство и принцип действия

Основные компоненты

Ультрацентрифуга состоит из следующих ключевых узлов:

• Ротор — вращающаяся часть, в которую помещаются пробирки или кюветы с образцом. Роторы изготавливаются из высокопрочных сплавов (титан, алюминий, композитные материалы) и могут быть угловыми (с фиксированным углом наклона пробирок) или бакетными (с подвесными стаканами, которые выравниваются под действием центробежной силы).
• Двигатель — высокооборотный электродвигатель, часто с воздушным или магнитным подвесом ротора для снижения вибрации и износа.
• Вакуумная система — откачивает воздух из камеры ротора для уменьшения нагрева и сопротивления.
• Система охлаждения — поддерживает заданную температуру (обычно от 0 до 40 °C) с помощью компрессора или термоэлектрических элементов.
• Система управления — микропроцессорный блок, задающий скорость, время, температуру и ускорение/замедление. Современные модели оснащены сенсорными дисплеями и возможностью программирования многоступенчатых протоколов.

Принцип действия

Центробежная сила, действующая на частицы в растворе, пропорциональна массе частицы, квадрату угловой скорости и расстоянию от оси вращения. В ультрацентрифуге эта сила в десятки и сотни тысяч раз превышает силу тяжести, что позволяет осаждать даже очень мелкие частицы (размером от 1 нм до 100 мкм) и макромолекулы. Разделение происходит по плотности и размеру: более плотные и крупные частицы оседают быстрее. В зависимости от режима работы различают:

• Препаративное центрифугирование — выделение фракций (например, митохондрий, рибосом) для дальнейшего анализа.
• Аналитическое центрифугирование — измерение скорости седиментации или равновесного распределения частиц для определения молекулярной массы, формы и взаимодействий.

Классификация

По назначению

• Препаративные ультрацентрифуги — предназначены для выделения и очистки биологических макромолекул, вирусов, клеточных органелл. Они имеют больший объём ротора (до нескольких литров) и менее точные оптические системы.
• Аналитические ультрацентрифуги — оснащены оптическими системами (ультрафиолетовое поглощение, интерференция, флуоресценция) для наблюдения за процессом седиментации в реальном времени. Используются для определения молекулярной массы, констант седиментации, коэффициентов диффузии и изучения взаимодействий.

По типу ротора

• Угловые роторы — пробирки расположены под фиксированным углом (обычно 20–45°) к оси вращения. Обеспечивают быстрое осаждение, но могут давать неравномерное распределение частиц.
• Бакетные роторы — пробирки в подвесных стаканах, которые во время вращения выравниваются горизонтально. Обеспечивают более чёткое разделение по плотности, но требуют больше времени.
• Роторы с зональным разделением — имеют специальные каналы для непрерывного ввода и вывода образца, используются для крупномасштабного фракционирования.

По скорости

• Высокоскоростные центрифуги — до 20 000–30 000 об/мин (ускорение до 50 000 g).
• Ультрацентрифуги — от 30 000 до 150 000 об/мин (ускорение до 1 000 000 g).

Применение

Биохимия и молекулярная биология

Ультрацентрифуги являются основным инструментом для:

• Выделения и очистки вирусов (например, вируса гриппа, ВИЧ, коронавируса SARS-CoV-2) — осаждение вирусных частиц из культуральной жидкости.
• Фракционирования клеточных органелл — митохондрий, лизосом, пероксисом, рибосом, ядер — методом дифференциального центрифугирования.
• Выделения плазмидной ДНК, РНК, белков — с использованием градиентов плотности (например, хлорид цезия, сахароза).
• Определения молекулярной массы и констант седиментации макромолекул (метод аналитического ультрацентрифугирования).

Медицина

• Диагностика — осаждение клеток крови, бактерий, вирусов для анализа (например, в клинических лабораториях для выделения плазмы).
• Производство вакцин — очистка вирусных частиц и компонентов клеток.
• Фармацевтика — контроль качества препаратов, определение чистоты и стабильности белковых лекарств (например, моноклональных антител).

Химия и материаловедение

• Исследование коллоидных систем — определение размера и распределения наночастиц.
• Разделение изотопов — хотя в промышленности этот метод не применяется, в лабораторных условиях ультрацентрифуги используются для обогащения образцов редкими изотопами.
• Характеристика полимеров — определение молекулярной массы и полидисперсности.

Промышленность

• Биотехнология — крупномасштабное выделение ферментов, антибиотиков, вакцин.
• Пищевая промышленность — осветление соков, вин, масел (редко, из-за высокой стоимости оборудования).

Примеры конкретных применений

Выделение вируса SARS-CoV-2

В период пандемии COVID-19 ультрацентрифуги использовались для очистки вирусных частиц из культуральной жидкости клеток Vero. Процесс включал предварительное осаждение клеточного дебриса при низкой скорости (10 000 g, 30 мин), затем ультрацентрифугирование при 100 000 g в течение 2 часов для осаждения вирионов. Полученный осадок ресуспендировали и использовали для инактивации и производства вакцин (например, «КовиВак» — вакцина, разработанная ФГБНУ «ФНЦИИ им. М. П. Чумакова РАН»).

Определение молекулярной массы гемоглобина

В 1920-х годах Теодор Сведберг с помощью аналитической ультрацентрифуги определил, что молекулярная масса гемоглобина человека составляет около 68 000 Да. Это стало одним из первых точных измерений молекулярной массы белка и подтвердило, что белки являются макромолекулами.

Интересные факты

• Максимальная скорость вращения ротора ультрацентрифуги (150 000 об/мин) соответствует линейной скорости на периферии ротора около 2 000 км/ч, что превышает скорость звука.
• Для предотвращения разрушения ротора от центробежных сил его изготавливают из титановых сплавов, которые выдерживают нагрузки до 1 000 000 g. При превышении предельной скорости ротор может разрушиться, что представляет серьёзную опасность.
• В СССР в 1970-х годах была разработана ультрацентрифуга «УЦ-1» с ротором из титана, способная работать при 80 000 об/мин. Она использовалась в Институте биохимии АН СССР.
• Аналитическое ультрацентрифугирование позволяет изучать взаимодействия белков (например, образование комплексов антиген-антитело) без их предварительной маркировки.

Источники

• Сведберг Т. «Ультрацентрифуга и её применение в биохимии» (1923).
• Фрейфельд В. Я. «Центрифуги и ультрацентрифуги» (Москва, 1965).
• Руководство по эксплуатации ультрацентрифуги Optima XE (Beckman Coulter, 2018).
• Статья «Ультрацентрифугирование» в Большой советской энциклопедии (3-е изд., 1977).
• Материалы конференции «Современные методы центрифугирования» (Москва, 2020).