Витрификация эмбрионов¶

Витрификация эмбрионов — это метод сверхбыстрого замораживания (криоконсервации) эмбрионов человека и животных, при котором биологический материал переводится в стеклообразное (аморфное) состояние без образования кристаллов льда. Данный метод позволяет сохранять эмбрионы при температуре жидкого азота (−196 °C) в течение неограниченного времени с минимальным повреждением клеточных структур.

¶История

Первые эксперименты по криоконсервации эмбрионов млекопитающих начались в 1970-х годах. Традиционный метод медленного замораживания (контролируемая скорость охлаждения) использовался до середины 2000-х годов, но имел существенные ограничения: образование кристаллов льда внутри клеток приводило к повреждению цитоскелета и органелл, что снижало выживаемость эмбрионов после размораживания до 30–50 %.

В 1985 году американский учёный Уильям Ролл (William Rall) и его коллеги впервые описали принцип витрификации для эмбрионов мышей. Однако практическое применение в репродуктивной медицине началось только в конце 1990-х — начале 2000-х годов, когда были разработаны эффективные криопротекторы и носители для сверхбыстрого охлаждения. В 2005–2006 годах появились первые коммерческие наборы для витрификации эмбрионов человека. К 2010-м годам метод вытеснил медленное замораживание в большинстве клиник репродукции в мире, включая Россию.

¶Физико-химические основы

Витрификация основана на принципе перехода жидкости в стеклообразное состояние при сверхбыстром охлаждении (скорость охлаждения — от 1000 до 30 000 °C в минуту). При такой скорости молекулы воды не успевают организоваться в кристаллическую решётку, и образуется аморфная (стекловидная) масса.

Ключевую роль играют криопротекторы — вещества, которые:

• Снижают температуру замерзания раствора;
• Повышают вязкость цитоплазмы;
• Предотвращают образование кристаллов льда.

Наиболее часто используются диметилсульфоксид (ДМСО), этиленгликоль, пропиленгликоль, сахароза и трегалоза. Для витрификации эмбрионов применяют смеси криопротекторов в высокой концентрации (обычно 15–20 % ДМСО и 15–20 % этиленгликоля).

¶Технология проведения

¶Подготовка эмбрионов

Эмбрионы, полученные в результате экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), культивируются до стадии бластоцисты (5–6 день развития) или более ранних стадий (2–3 день). Перед витрификацией их помещают в растворы криопротекторов с постепенно повышающейся концентрацией (обычно 2–3 этапа по 2–5 минут каждый).

¶Процесс замораживания

Эмбрион в минимальном объёме раствора (0,1–1 мкл) помещается на специальный носитель:

• Соломинки (straws) — тонкие пластиковые трубочки;
• Криотопы (Cryotop) — пластиковые полоски с углублением;
• Криолоки (Cryolock) — закрытые системы с защитным колпачком;
• Сетки (grids) — для больших объёмов.

Носитель с эмбрионом погружается непосредственно в жидкий азот. Время охлаждения составляет 1–3 секунды.

¶Хранение

Эмбрионы хранятся в специальных криохранилищах — сосудах Дьюара с жидким азотом. Срок хранения не ограничен: известны случаи успешной беременности после 10–15 лет хранения.

¶Размораживание (оттаивание)

Процесс проводится в обратном порядке: носитель извлекается из азота, эмбрион быстро переносится в растворы с понижающейся концентрацией криопротекторов (обычно 3–4 этапа по 2–5 минут). После отмывания от криопротекторов эмбрион помещается в культуральную среду для оценки жизнеспособности.

¶Преимущества и недостатки

¶Преимущества

• Высокая выживаемость: после витрификации выживает 90–98 % эмбрионов (по сравнению с 50–70 % при медленном замораживании);
• Сохранение качества: частота наступления беременности после переноса витрифицированных эмбрионов сопоставима со свежими эмбрионами;
• Скорость: процедура занимает 10–15 минут (медленное замораживание — 2–3 часа);
• Экономичность: не требуется дорогостоящее оборудование для программируемого замораживания;
• Возможность хранения неограниченное время.

¶Недостатки

• Токсичность криопротекторов: высокая концентрация может повреждать клетки, особенно при длительной экспозиции;
• Риск контаминации: при использовании открытых носителей (Cryotop) возможен контакт с жидким азотом, что теоретически может привести к заражению вирусами или бактериями;
• Требования к квалификации: процедура требует высокой точности и опыта персонала;
• Ограничения по размеру: крупные эмбрионы (например, на стадии бластоцисты) витрифицируются сложнее, чем мелкие.

¶Применение

¶Репродуктивная медицина

Витрификация эмбрионов широко используется в программах ЭКО:

• Криоконсервация избыточных эмбрионов: после переноса свежего эмбриона остальные замораживаются для будущих попыток;
• Отсроченный перенос: при риске синдрома гиперстимуляции яичников или других медицинских показаниях;
• Донорство эмбрионов: замороженные эмбрионы могут быть переданы другим парам;
• Преимплантационное генетическое тестирование: эмбрионы замораживаются до получения результатов анализа.

¶Животноводство

В сельском хозяйстве витрификация используется для сохранения генетического материала ценных пород крупного рогатого скота, овец, коз и лошадей. В России метод применяется в племенных хозяйствах для сохранения редких и исчезающих пород.

¶Сохранение биоразнообразия

Витрификация эмбрионов используется в программах сохранения исчезающих видов животных (например, амурского тигра, белого носорога) в рамках криобанков зоопарков и заповедников.

¶Правовые и этические аспекты в России

В Российской Федерации витрификация эмбрионов регулируется Федеральным законом «Об основах охраны здоровья граждан в РФ» (№ 323-ФЗ) и приказом Минздрава РФ «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий» (№ 803н от 31.07.2020). Основные положения:

• Хранение эмбрионов возможно только с письменного согласия обоих генетических родителей;
• Срок хранения — до 10 лет с возможностью продления;
• Эмбрионы могут быть уничтожены только по решению пациентов или в случае их смерти;
• Запрещено использование эмбрионов для коммерческих целей (продажа);
• Донорство эмбрионов допускается только на безвозмездной основе.

Этически спорным остаётся вопрос о судьбе эмбрионов, от которых отказались пациенты. В России такие эмбрионы могут быть уничтожены или переданы для научных исследований (с согласия доноров).

¶Сравнение с медленным замораживанием

¶Интересные факты

• Первый в мире ребёнок, родившийся после переноса витрифицированного эмбриона человека, появился на свет в 1999 году в Японии (клиника Kato Ladies Clinic).
• В 2020 году в России был зафиксирован случай рождения здорового ребёнка после 12 лет хранения эмбриона в жидком азоте.
• Витрификация позволяет сохранять не только эмбрионы, но и ооциты (яйцеклетки) — метод особенно популярен для отсрочки материнства.
• В некоторых странах (например, в Испании и США) существуют криобанки, где хранятся миллионы замороженных эмбрионов.

¶Источники

1. Федеральный закон «Об основах охраны здоровья граждан в РФ» № 323-ФЗ от 21.11.2011.
2. Приказ Минздрава РФ № 803н от 31.07.2020 «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий».
3. Rall W.F., Fahy G.M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at −196 °C by vitrification // Nature. — 1985. — Vol. 313. — P. 573–575.
4. Кулаков В.И., Леонов Б.В., Калинина Е.А. и др. Вспомогательные репродуктивные технологии: руководство для врачей. — М.: МИА, 2018. — 416 с.
5. Практические рекомендации Российской ассоциации репродукции человека (РАРЧ) по криоконсервации эмбрионов. — 2021.
6. Edgar D.H., Gook D.A. A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos // Human Reproduction Update. — 2012. — Vol. 18, № 5. — P. 536–554.