Криопротекторы

Криопротекторы — это химические вещества, которые предотвращают или минимизируют повреждение биологических тканей, клеток и органов при замораживании и последующем оттаивании. Они используются в криобиологии, криоконсервации, медицине (в частности, в репродуктологии и трансплантологии) и пищевой промышленности. Основной механизм действия криопротекторов заключается в снижении температуры замерзания внутриклеточной и внеклеточной жидкости, уменьшении образования кристаллов льда и предотвращении осмотического шока.

История

Первые научные работы по криопротекции относятся к середине XX века. В 1949 году британские учёные Кристофер Полдж и его коллеги обнаружили, что глицерин защищает сперматозоиды от повреждений при замораживании до −79 °C. Это открытие стало основой для разработки методов криоконсервации спермы и эмбрионов. В 1950-х годах были изучены диметилсульфоксид (ДМСО) и другие проникающие криопротекторы. В 1960-х годах началось применение криопротекторов в криохирургии и для сохранения клеток крови. В 1980-х годах с развитием репродуктивных технологий криопротекторы стали широко использоваться в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). В XXI веке исследования сосредоточены на разработке криопротекторов для криоконсервации целых органов и тканей, а также на создании менее токсичных и более эффективных составов.

Классификация

Криопротекторы делятся на два основных типа по способности проникать через клеточную мембрану.

Проникающие криопротекторы

Эти вещества проходят через клеточную мембрану и накапливаются внутри клетки. Они замещают внутриклеточную воду, снижают осмотическое давление и предотвращают образование крупных кристаллов льда. К ним относятся:

• Диметилсульфоксид (ДМСО) — один из наиболее распространённых криопротекторов, используется для криоконсервации клеток, тканей и эмбрионов. Обладает низкой токсичностью при кратковременном воздействии.
• Глицерин — применяется для криоконсервации сперматозоидов, эритроцитов и некоторых типов клеток. Менее токсичен, чем ДМСО, но требует более длительного времени для проникновения.
• Этиленгликоль — используется в криоконсервации эмбрионов и ооцитов, а также в некоторых промышленных процессах.
• Пропиленгликоль — применяется в пищевой промышленности и для криоконсервации биологических образцов.
• Метанол — реже используется из-за высокой токсичности, но применяется в некоторых экспериментальных протоколах.

Непроникающие криопротекторы

Эти вещества остаются во внеклеточном пространстве и не проникают внутрь клетки. Они действуют за счёт повышения осмотического давления внеклеточной среды, что вызывает обезвоживание клетки и снижает риск образования внутриклеточного льда. К ним относятся:

• Сахароза — широко используется в криоконсервации эмбрионов и ооцитов, особенно в сочетании с проникающими криопротекторами.
• Трегалоза — природный дисахарид, который стабилизирует клеточные мембраны и белки. Применяется в криоконсервации стволовых клеток и спермы.
• Поливинилпирролидон (ПВП) — синтетический полимер, используется для криоконсервации клеток крови и некоторых тканей.
• Гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) — применяется для криоконсервации эритроцитов и тромбоцитов.
• Декстраны — полисахариды, используемые в криоконсервации клеток и тканей.

Механизм действия

Криопротекторы предотвращают повреждение клеток при замораживании за счёт нескольких механизмов:

• Снижение температуры замерзания — криопротекторы понижают точку замерзания раствора, что позволяет клеткам оставаться в жидкой фазе при более низких температурах.
• Предотвращение кристаллизации льда — проникающие криопротекторы замещают воду внутри клетки, уменьшая количество свободной воды, которая может образовать кристаллы. Непроникающие криопротекторы создают высокое осмотическое давление снаружи, вызывая обезвоживание клетки, что также снижает риск внутриклеточного льдообразования.
• Стабилизация мембран и белков — некоторые криопротекторы (например, трегалоза) взаимодействуют с фосфолипидными мембранами и белками, предотвращая их денатурацию и разрушение при замораживании.
• Осмотическая защита — криопротекторы регулируют осмотическое давление, предотвращая резкие изменения объёма клетки при замораживании и оттаивании.

Применение

Медицина и репродуктология

Криопротекторы используются для криоконсервации спермы, ооцитов, эмбрионов и стволовых клеток. В программах ЭКО замороженные эмбрионы и ооциты хранятся в жидком азоте при температуре −196 °C. Для этого применяются комбинации проникающих и непроникающих криопротекторов, например, ДМСО с сахарозой или этиленгликоль с трегалозой. Криоконсервация спермы широко используется в донорских программах и для сохранения фертильности у пациентов перед химиотерапией.

Трансплантология

Криоконсервация целых органов (почек, печени, сердца) остаётся сложной задачей из-за их большого размера и сложной структуры. Криопротекторы применяются для перфузии органов перед замораживанием, но полное сохранение функции органа после оттаивания пока не достигнуто. Исследования ведутся в области витрификации — сверхбыстрого замораживания с использованием высоких концентраций криопротекторов.

Пищевая промышленность

Криопротекторы используются для сохранения качества замороженных продуктов. Например, глицерин и пропиленгликоль добавляют в мороженое, чтобы предотвратить образование крупных кристаллов льда и сохранить текстуру. Трегалоза применяется для защиты клеток дрожжей в замороженном тесте.

Криохирургия

В криохирургии криопротекторы могут использоваться для защиты здоровых тканей вокруг опухоли при локальном замораживании. Однако их применение ограничено из-за риска токсичности.

Токсичность и ограничения

Криопротекторы обладают цитотоксичностью, особенно при высоких концентрациях и длительном воздействии. ДМСО может вызывать повреждение клеток, а также обладает побочными эффектами при введении в организм (например, тошнота, головокружение). Глицерин и этиленгликоль менее токсичны, но их эффективность ниже. Для снижения токсичности применяются комбинации криопротекторов в меньших концентрациях, а также добавление антиоксидантов и стабилизаторов.

Другие ограничения включают:

• Осмотический стресс — при добавлении и удалении криопротекторов клетки могут испытывать резкие изменения объёма, что приводит к повреждению.
• Необходимость быстрого оттаивания — для предотвращения рекристаллизации льда требуется контролируемая скорость оттаивания.
• Сложность для крупных образцов — для целых органов и тканей требуется равномерное распределение криопротектора, что технически сложно.

Исследования и перспективы

Современные исследования направлены на разработку новых криопротекторов с низкой токсичностью и высокой эффективностью. Изучаются природные криопротекторы, такие как трегалоза, пролин и глицинбетаин, которые встречаются в организмах, устойчивых к замораживанию (например, у арктических рыб и насекомых). Также разрабатываются наночастицы и гидрогели для доставки криопротекторов в клетки.

В области криоконсервации органов ведутся работы по витрификации — процессу, при котором образец замораживается так быстро, что вода переходит в стеклообразное состояние без образования кристаллов льда. Для этого требуются высокие концентрации криопротекторов (до 40–60 %), что увеличивает риск токсичности. Перспективным считается использование комбинаций криопротекторов с добавлением антифризных белков (например, из арктических рыб) для стабилизации льда.

Интересные факты

• Некоторые организмы, такие как арктические рыбы и насекомые, синтезируют собственные криопротекторы (например, глицерин и трегалозу), что позволяет им переживать замораживание.
• В 2010-х годах были разработаны протоколы криоконсервации целых органов, таких как почки, с использованием витрификации, но полное восстановление функции после оттаивания пока не достигнуто.
• Криопротекторы используются не только в биологии, но и в технике — например, для защиты электронных компонентов при низких температурах.

Источники

• Криобиология и криоконсервация: учебное пособие / под ред. В. И. Грищенко. — М.: Медицина, 2005.
• Fuller B. J., Lane N., Benson E. E. Life in the Frozen State. — CRC Press, 2004.
• Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications // American Journal of Physiology. — 1984. — Vol. 247, № 3. — P. C125–C142.
• Fahy G. M., Wowk B. Principles of cryopreservation by vitrification // Cryobiology. — 2007. — Vol. 55, № 3. — P. 227–234.
• Kuleshova L. L., Shaw J. M. A strategy for rapid cooling of mouse embryos within a double straw to eliminate the effect of the ice crystal formation // Cryobiology. — 2000. — Vol. 41, № 1. — P. 1–10.