Высокоэффективная жидкостная хроматография

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, англ. High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) — это физико-химический метод разделения, идентификации и количественного определения компонентов сложных смесей, основанный на различии в скорости перемещения веществ через неподвижную фазу под действием потока жидкой подвижной фазы под высоким давлением. ВЭЖХ является одним из наиболее распространённых и универсальных методов аналитической химии, позволяющим анализировать как летучие, так и нелетучие, термически нестабильные и полярные соединения, которые не поддаются анализу методом газовой хроматографии.

История

Развитие жидкостной хроматографии началось в начале XX века с работ русского ботаника и физиолога растений Михаила Семёновича Цвета, который в 1903 году впервые применил метод колоночной хроматографии для разделения растительных пигментов. Однако классическая колоночная хроматография была медленной и малопроизводительной из-за низкой скорости прохождения элюента через колонку под действием силы тяжести.

Прорыв произошёл в 1960-х — 1970-х годах, когда были разработаны насосы высокого давления, способные прокачивать жидкость через колонки, заполненные частицами сорбента малого диаметра (3–10 мкм). Это позволило значительно увеличить скорость разделения и эффективность колонок. В 1969 году американский химик Джек Киркланд (Jack Kirkland) из компании DuPont и его коллеги представили первые коммерческие системы ВЭЖХ. В 1970-е годы метод получил широкое распространение благодаря развитию теории хроматографии, созданию высокочувствительных детекторов (УФ-спектрофотометрических, флуоресцентных, рефрактометрических) и автоматизации процесса.

Принцип метода

ВЭЖХ основана на распределении анализируемых веществ между двумя фазами: неподвижной (сорбент, помещённый в колонку) и подвижной (элюент, жидкость, прокачиваемая через колонку). Проба смеси вводится в поток подвижной фазы и проходит через колонку. Компоненты смеси взаимодействуют с неподвижной фазой с разной силой: те, которые слабее удерживаются сорбентом, движутся быстрее и выходят из колонки раньше; те, которые удерживаются сильнее, — позже. Время от момента ввода пробы до выхода компонента из колонки называется временем удерживания и является качественной характеристикой вещества.

Ключевым отличием ВЭЖХ от классической жидкостной хроматографии является использование высокого давления (от 50 до 400 атм и выше), создаваемого насосом, что позволяет прокачивать элюент через колонки с мелкими частицами сорбента (1,5–10 мкм) с высокой скоростью, обеспечивая быстрое и эффективное разделение.

Классификация по механизму разделения

ВЭЖХ классифицируется в зависимости от природы взаимодействия между анализируемыми веществами и неподвижной фазой.

Адсорбционная хроматография (нормально-фазовая ВЭЖХ, НФ-ВЭЖХ)

Неподвижная фаза — полярный сорбент (например, силикагель, оксид алюминия). Подвижная фаза — неполярный или малополярный органический растворитель (гексан, изопропанол, этилацетат). Разделение основано на различной способности веществ адсорбироваться на полярной поверхности. Полярные соединения удерживаются сильнее и элюируются позже. Применяется для разделения неполярных и слабополярных соединений, например, липидов, витаминов, стероидов.

Обращённо-фазовая хроматография (ОФ-ВЭЖХ)

Наиболее распространённый вариант ВЭЖХ. Неподвижная фаза — неполярный сорбент, полученный путём химической модификации силикагеля алкильными группами (чаще всего C18 — октадецилсилан, реже C8, C4, фенильные группы). Подвижная фаза — полярная смесь воды и органического растворителя (ацетонитрил, метанол, тетрагидрофуран). Разделение основано на гидрофобных взаимодействиях: неполярные (гидрофобные) соединения сильнее удерживаются неполярной неподвижной фазой и элюируются позже. ОФ-ВЭЖХ применяется для разделения широкого круга соединений: аминокислот, пептидов, белков, нуклеиновых кислот, лекарственных веществ, пестицидов, полициклических ароматических углеводородов.

Ионообменная хроматография (ИОХ)

Неподвижная фаза — сорбент, содержащий ионогенные группы (катиониты или аниониты). Разделение основано на обратимом ионном обмене между ионами анализируемого вещества и ионами, входящими в состав сорбента. Подвижная фаза — водный буферный раствор с определённым pH и ионной силой. Применяется для разделения ионов, аминокислот, нуклеотидов, белков, органических кислот.

Эксклюзионная хроматография (гель-фильтрация, гель-проникающая хроматография)

Разделение основано на различии в размере молекул. Неподвижная фаза — пористый гель (например, сшитый декстран, полиакриламид, силикагель с определённым размером пор). Молекулы, которые меньше пор, проникают внутрь гранул сорбента и задерживаются; крупные молекулы, не проникающие в поры, элюируются первыми. Применяется для разделения полимеров, белков, нуклеиновых кислот, для определения молекулярной массы.

Хиральная хроматография

Специализированный вариант ВЭЖХ для разделения оптических изомеров (энантиомеров). Используются хиральные неподвижные фазы (например, модифицированные циклодекстринами, целлюлозой, белками) или хиральные добавки в подвижную фазу. Применяется в фармацевтике для контроля энантиомерной чистоты лекарственных веществ.

Оборудование для ВЭЖХ

Типичная система ВЭЖХ состоит из следующих основных модулей:

1. Резервуары для подвижной фазы — ёмкости для растворителей, часто с системой дегазации (продувка гелием, вакуумная дегазация) для удаления растворённых газов, которые могут вызывать шум детектора и образование пузырьков.
2. Насос высокого давления — обеспечивает постоянный и воспроизводимый поток элюента через колонку. Различают изократические насосы (постоянный состав элюента) и градиентные насосы (способные изменять состав элюента во времени, что позволяет оптимизировать разделение сложных смесей).
3. Инжектор (устройство ввода пробы) — служит для введения точного объёма анализируемой пробы в поток элюента. В современных системах используются автоматические пробоотборники (автосемплеры), обеспечивающие высокую точность и автоматизацию.
4. Хроматографическая колонка — основной элемент системы, в котором происходит разделение. Представляет собой трубку из нержавеющей стали или полимерных материалов, заполненную сорбентом. Длина колонок варьируется от 3 до 30 см, внутренний диаметр — от 1 до 10 мм. Для ВЭЖХ используются колонки с частицами сорбента размером 1,5–10 мкм. Существуют также колонки с монолитными сорбентами, представляющими собой единую пористую структуру.
5. Детектор — устройство, регистрирующее изменение концентрации анализируемых веществ в элюенте на выходе из колонки. Наиболее распространённые типы детекторов:

• УФ-спектрофотометрический (УФ-детектор) — измеряет поглощение света в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Наиболее универсальный детектор.
• Флуоресцентный детектор — регистрирует собственную флуоресценцию веществ или флуоресценцию после дериватизации. Обладает высокой чувствительностью и селективностью.
• Рефрактометрический детектор — измеряет разницу показателей преломления между чистым элюентом и элюентом с аналитом. Универсален, но менее чувствителен.
• Масс-спектрометрический детектор (МС-детектор) — обеспечивает идентификацию веществ по их молекулярной массе и фрагментации. Является наиболее информативным, но дорогим и сложным в эксплуатации.
• Электрохимические детекторы (амперометрический, кулонометрический) — регистрируют ток, возникающий при окислении или восстановлении анализируемых веществ на электроде.

1. Система сбора и обработки данных — компьютер с программным обеспечением, которое управляет работой системы, записывает хроматограммы, интегрирует пики и рассчитывает количественные результаты.

Применение

ВЭЖХ является одним из ключевых методов анализа в самых разных областях науки и промышленности.

• Фармацевтическая промышленность и медицина: контроль качества лекарственных средств (анализ активных фармацевтических субстанций, примесей, продуктов распада), определение содержания лекарств в биологических жидкостях (фармакокинетика), клиническая диагностика (анализ аминокислот, витаминов, гормонов, метаболитов).
• Пищевая промышленность: контроль качества продуктов питания (определение подсластителей, консервантов, красителей, витаминов, кофеина, жирных кислот, пестицидов, микотоксинов).
• Экология и охрана окружающей среды: анализ воды, почвы, воздуха на содержание загрязнителей (фенолы, полициклические ароматические углеводороды, пестициды, гербициды, промышленные токсиканты).
• Химическая промышленность: контроль качества сырья и готовой продукции, анализ полимеров, поверхностно-активных веществ, красителей, катализаторов.
• Биохимия и молекулярная биология: разделение и очистка белков, пептидов, нуклеиновых кислот, аминокислот, углеводов, липидов.
• Криминалистика и судебная экспертиза: анализ наркотических и психотропных веществ, взрывчатых веществ, ядов, чернил, волокон.

Преимущества и недостатки

Преимущества:

• Высокая эффективность разделения (до нескольких десятков тысяч теоретических тарелок на колонку).
• Быстрота анализа (от нескольких минут до часа).
• Высокая чувствительность (до пикограммовых количеств при использовании флуоресцентного или масс-спектрометрического детектирования).
• Возможность анализа нелетучих, термически нестабильных и полярных соединений.
• Количественный анализ с высокой точностью и воспроизводимостью.
• Автоматизация процесса.

Недостатки:

• Высокая стоимость оборудования и расходных материалов (колонки, растворители высокой чистоты).
• Необходимость квалифицированного обслуживания и подготовки персонала.
• Ограниченная возможность идентификации неизвестных соединений без использования масс-спектрометрии.
• Чувствительность к загрязнениям пробы и элюента.
• Относительно высокий расход растворителей (особенно в градиентном режиме).

Интересные факты

• Современные системы ВЭЖХ способны создавать давление до 1500 атм (ультра-ВЭЖХ, UHPLC), что позволяет использовать колонки с частицами сорбента менее 2 мкм и сокращать время анализа до нескольких секунд.
• ВЭЖХ является обязательным методом контроля качества в фармакопеях большинства стран мира, включая Государственную фармакопею Российской Федерации.
• Метод ВЭЖХ используется для анализа состава нефти и нефтепродуктов, включая определение содержания бензола, толуола, ксилолов и других ароматических углеводородов.
• В биотехнологии ВЭЖХ применяется для очистки рекомбинантных белков, в том числе терапевтических моноклональных антител.

Источники

1. Сычев К. С. Высокоэффективная жидкостная хроматография. — М.: Техносфера, 2019.
2. Шапиро Ю. Е. Высокоэффективная жидкостная хроматография: учебное пособие. — М.: Издательство Юрайт, 2020.
3. Линднер В. Высокоэффективная жидкостная хроматография. — М.: Мир, 1988.
4. Государственная фармакопея Российской Федерации, XIV издание, том 1, ОФС.1.2.1.2.0001.15 «Высокоэффективная жидкостная хроматография».
5. Meyer V. R. Practical High-Performance Liquid Chromatography. — 5th ed. — Wiley, 2010.