Western blotting

Western blotting (вестерн-блоттинг, также известный как иммуноблоттинг или белковый иммуноблот) — это аналитический метод молекулярной биологии и биохимии, используемый для детекции специфических белков в образце тканевого гомогената или экстракта. Метод основан на комбинации гель-электрофореза для разделения белков по молекулярной массе и последующего переноса (блоттинга) на мембрану с последующей иммунохимической детекцией с помощью антител. Western blotting позволяет идентифицировать белок, оценить его относительное количество и молекулярную массу, а также выявить посттрансляционные модификации. Является одним из стандартных методов в протеомике, медицинской диагностике (например, подтверждение ВИЧ-инфекции) и научных исследованиях.

История

Метод Western blotting был разработан в 1979 году группой ученых под руководством У. Нил Бернетта (W. Neal Burnette) в лаборатории Стэнфордского университета. Термин «Western blot» был предложен как юмористическая параллель с уже существовавшими методами «Southern blot» (по имени Эдвина Саузерна, разработавшего метод детекции ДНК) и «Northern blot» (для РНК). В 1981 году метод был независимо описан Гарри Таубином (Harry Towbin) и его коллегами, которые впервые применили электрофоретический перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану. В последующие десятилетия метод был значительно усовершенствован: появились различные типы мембран (PVDF, нейлон), системы полусухого и сухого переноса, а также высокочувствительные методы детекции (хемилюминесценция, флуоресценция).

Принцип метода

Western blotting включает три основных этапа: разделение белков, перенос на мембрану и иммунохимическая детекция.

Разделение белков

На первом этапе белки разделяются по молекулярной массе с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). SDS — анионный детергент, который денатурирует белки и придает им отрицательный заряд, пропорциональный их массе. В результате белки мигрируют в электрическом поле к аноду, причем меньшие молекулы движутся быстрее. Для оценки молекулярной массы используют маркеры (стандарты) — смесь белков известной массы.

Перенос на мемфору

После электрофореза белки переносятся (блоттируются) из геля на твердую мембрану (обычно нитроцеллюлозную или поливинилиденфторидную (PVDF)). Перенос осуществляется с помощью электрического тока (электроблоттинг) в специальной камере. Существуют два основных режима: мокрый перенос (гель и мембрана погружены в буфер) и полусухой перенос (гель и мембрана зажаты между электродами, смоченными буфером). В результате белки фиксируются на мембране, сохраняя свои антигенные свойства.

Иммунохимическая детекция

После переноса мембрану обрабатывают блокирующим раствором (обычно обезжиренное молоко или бычий сывороточный альбумин), чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител. Затем мембрану инкубируют с первичными антителами — антителами, специфичными к целевому белку. После отмывки несвязавшихся антител добавляют вторичные антитела, конъюгированные с ферментом (например, пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой) или флуорофором. Вторичные антитела распознают константную область первичных антител. Детекция осуществляется с помощью хемилюминесцентного субстрата (для ферментных меток) или флуоресцентного сканера. Интенсивность сигнала пропорциональна количеству белка.

Классификация и модификации

По типу переноса

• Мокрый перенос — классический метод, обеспечивающий равномерный перенос, но требующий больше времени (1-2 часа).
• Полусухой перенос — более быстрый (15-30 минут), но может давать неравномерный перенос для высокомолекулярных белков.
• Сухой перенос — автоматизированный метод, использующий специальные кассеты и буферные системы.

По типу детекции

• Хемилюминесцентная детекция — наиболее распространенный метод, основанный на ферментативной реакции, дающей световой сигнал. Требует использования рентгеновской пленки или CCD-камеры.
• Флуоресцентная детекция — использование вторичных антител, меченных флуорофорами, позволяет проводить мультиплексный анализ (одновременная детекция нескольких белков) и количественную оценку.
• Колориметрическая детекция — менее чувствительный метод, основанный на образовании окрашенного продукта на мембране.

По количеству детектируемых белков

• Однополосный блоттинг — детекция одного белка.
• Мультиплексный блоттинг — одновременная детекция нескольких белков с использованием антител, меченных разными флуорофорами или ферментами.

Применение

Научные исследования

• Изучение экспрессии белков — оценка уровня синтеза белка в клетках и тканях при различных условиях (например, при действии лекарств, стресса, дифференцировки).
• Идентификация посттрансляционных модификаций — детекция фосфорилирования, гликозилирования, убиквитинирования и других модификаций с помощью специфических антител.
• Верификация данных протеомики — подтверждение результатов масс-спектрометрии.
• Изучение белок-белковых взаимодействий — в сочетании с иммунопреципитацией (Co-IP).

Медицинская диагностика

• Подтверждение ВИЧ-инфекции — Western blotting является «золотым стандартом» для подтверждения положительных результатов ИФА (иммуноферментного анализа) на ВИЧ. Метод позволяет детектировать антитела к специфическим белкам вируса (например, gp120, p24). В России этот метод используется в соответствии с приказом Минздрава РФ.
• Диагностика болезни Лайма — выявление антител к Borrelia burgdorferi.
• Диагностика прионных заболеваний — детекция аномального прионного белка.
• Скрининг аутоиммунных заболеваний — выявление аутоантител к собственным белкам (например, при системной красной волчанке).

Биотехнология и фармацевтика

• Контроль качества рекомбинантных белков — подтверждение чистоты и идентичности белковых препаратов.
• Разработка вакцин — оценка иммуногенности белковых компонентов.

Преимущества и недостатки

Преимущества

• Высокая специфичность благодаря использованию антител.
• Возможность детекции белков в сложных смесях (клеточные лизаты, тканевые экстракты).
• Возможность оценки молекулярной массы белка.
• Относительно низкая стоимость по сравнению с масс-спектрометрией.
• Возможность количественной оценки (с использованием нормализации по «housekeeping» белкам).

Недостатки

• Трудоемкость и длительность (от 4 до 24 часов).
• Необходимость в специфических антителах, которые могут быть дорогими или недоступными.
• Ограниченная чувствительность (обычно 1-10 нг белка).
• Возможность неспецифического связывания антител, приводящего к ложноположительным результатам.
• Невозможность детекции белков с очень низкой молекулярной массой (менее 10 кДа) или очень высокой (более 500 кДа).
• Зависимость качества результата от качества антител и условий эксперимента.

Критика и альтернативы

В последние годы Western blotting подвергается критике за низкую воспроизводимость результатов между лабораториями, что связано с вариабельностью антител, условий блокировки, отмывки и детекции. В ответ на это были разработаны протоколы стандартизации (например, рекомендации журнала Nature). Альтернативными методами являются:

• ELISA (иммуноферментный анализ) — более быстрый и количественный, но не дает информации о молекулярной массе.
• Масс-спектрометрия — более точный и информативный метод, но требует дорогостоящего оборудования.
• Масс-спектрометрия с параллельной реакцией мониторинга (PRM) — позволяет детектировать белки без антител.
• Протеомные микрочипы — для высокопроизводительного скрининга.

Интересные факты

• Название «Western blot» было предложено в 1981 году У. Нил Бернеттом как шутка, поскольку метод был «западным» (western) по отношению к «южному» (Southern) и «северному» (Northern) блоттингам.
• В 2012 году метод Western blotting был признан одним из 10 самых цитируемых методов в биологии.
• В некоторых лабораториях для детекции используют радиоактивные метки (например, 125I), но из-за радиационной опасности этот метод практически вытеснен хемилюминесценцией.

Источники

• Burnette, W. N. (1981). «Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A». Analytical Biochemistry.
• Towbin, H., Staehelin, T., & Gordon, J. (1979). «Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications». Proceedings of the National Academy of Sciences.
• Kurien, B. T., & Scofield, R. H. (2006). «Western blotting: an introduction». Methods in Molecular Biology.
• Приказ Министерства здравоохранения РФ от 8 ноября 2012 г. № 689н «Об утверждении порядка оказания медицинской помощи взрослому населению при инфекционных заболеваниях, вызываемых вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекции)».