Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА) — это лабораторный метод качественного и количественного определения различных соединений (антигенов, антител, гормонов, ферментов, лекарственных препаратов) в биологических жидкостях (сыворотке крови, плазме, моче, спинномозговой жидкости), основанный на специфической реакции связывания антигена с антителом и использовании ферментной метки для детекции образовавшегося комплекса. ИФА относится к гетерогенным иммунохимическим методам анализа и является одним из наиболее распространённых и чувствительных способов диагностики в медицине, ветеринарии, биохимии и пищевой промышленности.

История

Основы метода были заложены в середине XX века. В 1960 году Розалин Ялоу и Соломон Берсон разработали радиоиммунный анализ (РИА), который впервые позволил измерять концентрации биологически активных веществ с высокой точностью. Однако РИА имел существенные недостатки, связанные с использованием радиоактивных изотопов, что требовало специального оборудования и мер безопасности.

В 1971 году шведские исследователи Эва Энгвалл и Перлманн, а также независимо от них нидерландские учёные Б. ван Вем и А. Шуурс, предложили заменить радиоактивную метку на ферментную. Это позволило создать безопасный, дешёвый и доступный для широкого круга лабораторий метод. Первый коммерческий набор для ИФА появился в 1974 году. С тех пор метод постоянно совершенствовался: разрабатывались новые типы твёрдых фаз (полистироловые планшеты, магнитные частицы), улучшались системы детекции (хемилюминесцентные субстраты) и автоматизировались процессы.

Принцип метода

ИФА основан на двух ключевых свойствах иммунной системы: высокой специфичности взаимодействия антитела с антигеном и возможности ковалентного присоединения к антителу фермента (например, пероксидазы хрена или щелочной фосфатазы), активность которого легко измерить.

Основные этапы (на примере «сэндвич»-варианта)

1. Иммобилизация: Антитела (или антигены) адсорбируются на поверхности твёрдой фазы — обычно в лунках 96-луночного полистиролового планшета.
2. Блокировка: Для предотвращения неспецифического связывания в лунки добавляют инертный белок (например, бычий сывороточный альбумин).
3. Инкубация с образцом: В лунки вносят исследуемый биологический материал. Если в нём присутствует искомый антиген, он связывается с иммобилизованными антителами.
4. Отмывка: Несвязавшиеся компоненты образца удаляют промывкой.
5. Инкубация с конъюгатом: Добавляют вторые антитела, меченные ферментом, которые специфичны к другому участку искомого антигена. Образуется «сэндвич»: первое антитело — антиген — второе антитело с ферментом.
6. Отмывка: Удаляют избыток конъюгата.
7. Добавление субстрата: Вносят хромогенный субстрат, который под действием фермента изменяет цвет (например, бесцветный тетраметилбензидин (ТМБ) становится синим).
8. Остановка реакции: Добавляют стоп-реагент (обычно серную кислоту), который меняет цвет с синего на жёлтый.
9. Измерение: Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре (ридере) при определённой длине волны (например, 450 нм). Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации искомого вещества в образце.

Классификация

ИФА классифицируют по нескольким признакам.

По типу анализируемого вещества

• Твердофазный ИФА (ELISA): Наиболее распространённый тип, где один из реагентов (антиген или антитело) иммобилизован на твёрдой поверхности.
• Гомогенный ИФА: Не требует разделения связавшихся и свободных компонентов, используется реже, в основном для анализа низкомолекулярных соединений.

По способу детекции

• Прямой ИФА: Антиген, иммобилизованный на планшете, выявляется мечеными антителами.
• Непрямой ИФА: Антиген выявляется немечеными первичными антителами, которые затем распознаются мечеными вторичными антителами (против иммуноглобулинов первого вида).
• Сэндвич-ИФА: Используется пара антител, распознающих разные эпитопы одного антигена. Обеспечивает высокую специфичность.
• Конкурентный ИФА: Применяется для анализа малых молекул (гаптенов). Аналит в образце конкурирует с меченым аналогом за связывание с ограниченным количеством антител.

По типу метки

• Колориметрический: Субстрат даёт окрашенный продукт.
• Флуоресцентный: Субстрат даёт флуоресцентный сигнал (FLISA).
• Хемилюминесцентный: Субстрат испускает свет (CLIA). Обеспечивает наивысшую чувствительность.

Применение

ИФА применяется в самых разных областях благодаря своей высокой чувствительности (до 10⁻¹² г/мл), специфичности и возможности автоматизации.

В медицине

• Диагностика инфекционных заболеваний: Выявление антител к возбудителям (ВИЧ, гепатиты B и C, сифилис, краснуха, токсоплазмоз, коронавирусная инфекция) или антигенов возбудителей (например, HBsAg вируса гепатита B).
• Гормональные исследования: Определение уровня тиреотропного гормона (ТТГ), кортизола, инсулина, половых гормонов.
• Онкомаркеры: Количественное определение простатспецифического антигена (ПСА), альфа-фетопротеина (АФП), раково-эмбрионального антигена (РЭА).
• Аутоиммунные заболевания: Выявление аутоантител (например, к ДНК, тиреоглобулину, ревматоидному фактору).
• Аллергология: Определение специфических иммуноглобулинов класса E (IgE) к различным аллергенам.

В ветеринарии

Диагностика инфекционных заболеваний животных (лейкоз крупного рогатого скота, бешенство, чума плотоядных), определение уровня гормонов и контроль вакцинации.

В пищевой промышленности

• Контроль качества: Выявление фальсификации мяса (видовая принадлежность), определение содержания соевого белка.
• Безопасность: Обнаружение аллергенов (арахис, глютен, молоко), микотоксинов (афлатоксины, охратоксин), остаточных количеств антибиотиков и пестицидов.

В биохимии и экологии

• Фундаментальные исследования: Изучение белковых взаимодействий, картирование эпитопов.
• Экологический мониторинг: Определение концентрации пестицидов, гербицидов и промышленных загрязнителей в воде и почве.

Преимущества и недостатки

Преимущества

• Высокая чувствительность и специфичность.
• Безопасность: Отсутствие работы с радиоактивными изотопами.
• Количественный результат: Возможность точного определения концентрации.
• Автоматизация: Процесс может быть полностью автоматизирован, что снижает влияние человеческого фактора и увеличивает пропускную способность.
• Стабильность реагентов: Ферментные метки и субстраты могут храниться длительное время.
• Относительно низкая стоимость по сравнению с масс-спектрометрией или ПЦР в реальном времени.

Недостатки

• Сложность разработки: Для каждого нового аналита требуется подбор специфических антител и оптимизация условий.
• Влияние матрикса: Компоненты биологической жидкости могут неспецифически связываться с планшетом, что приводит к ложноположительным результатам.
• Перекрёстная реактивность: Антитела могут распознавать структурно сходные молекулы, что снижает специфичность.
• Ограниченный диапазон измерения: При высоких концентрациях антигена может наблюдаться «эффект Хука» (прокон-зона), когда избыток антигена приводит к снижению сигнала.
• Необходимость оборудования: Требуется спектрофотометр для считывания результатов.

Интересные факты

• Первый коммерческий набор для ИФА был разработан для диагностики гепатита B.
• В 1985 году ИФА был впервые использован для скрининга донорской крови на ВИЧ, что кардинально снизило риск заражения при переливании.
• «Сэндвич»-вариант ИФА позволяет выявлять антиген даже в присутствии большого количества антител к нему, что важно для диагностики хронических инфекций.
• Современные автоматизированные системы ИФА могут обрабатывать до нескольких сотен образцов в час, выполняя все этапы — от дозирования до выдачи результата.

Источники

1. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry, 1971.
2. Van Weemen B. K., Schuurs A. H. W. M. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. FEBS Letters, 1971.
3. Crowther J. R. The ELISA Guidebook. Humana Press, 2009.
4. Gosling J. P. A decade of development in immunoassay methodology. Clinical Chemistry, 1990.
5. Porstmann T., Kiessig S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods, 1992.