Эксцизионная репарация нуклеотидов¶

Эксцизионная репарация нуклеотидов (ЭРН, англ. nucleotide excision repair, NER) — это один из основных механизмов репарации ДНК, предназначенный для удаления обширных повреждений, которые искажают двойную спираль ДНК. В отличие от эксцизионной репарации оснований (BER), которая удаляет небольшие, неискажающие повреждения, ЭРН способна вырезать участок олигонуклеотида длиной 24–32 нуклеотида, содержащий повреждение, с последующим синтезом новой цепи по матрице неповреждённой комплементарной цепи. Данный процесс является эволюционно консервативным и обнаружен у всех организмов, от бактерий до человека. Нарушения в работе ЭРН у человека приводят к тяжёлым наследственным заболеваниям, в частности к пигментной ксеродерме (XP), синдрому Коккейна (CS) и трихотиодистрофии (TTD).

¶История открытия

Первые экспериментальные данные о существовании механизма, способного удалять крупные повреждения ДНК, были получены в 1960-х годах. В 1964 году американские исследователи Ричард Сетлоу и Уильям Кэрриер показали, что бактерии Escherichia coli способны вырезать тиминовые димеры, образующиеся под действием ультрафиолетового (УФ) излучения, в составе коротких фрагментов ДНК. Дальнейшие работы в лаборатории Азиза Санкара и других групп позволили выделить и охарактеризовать ферменты, участвующие в этом процессе. В 1970-х годах были идентифицированы ключевые гены репарации у бактерий (гены uvrA, uvrB, uvrC), а затем и у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (гены RAD). В 1990-е годы, благодаря исследованиям пациентов с пигментной ксеродермой, были клонированы гены, кодирующие белки ЭРН человека (XPA, XPB, XPC и др.). За открытие механизмов эксцизионной репарации нуклеотидов в 2015 году Нобелевская премия по химии была присуждена Азизу Санкару, Полу Модричу и Томасу Линдалю.

¶Классификация и подтипы

Эксцизионная репарация нуклеотидов подразделяется на два основных подтипа в зависимости от механизма распознавания повреждения:

• Глобальная геномная репарация (Global Genome Repair, GGR) — сканирует всю ДНК на предмет искажений структуры спирали. У эукариот этот процесс инициируется комплексом XPC-RAD23B, который распознаёт общие структурные дефекты, а не конкретные химические модификации.
• Транскрипционно-связанная репарация (Transcription-Coupled Repair, TCR) — удаляет повреждения с транскрибируемой цепи активно экспрессирующихся генов. Инициируется при остановке РНК-полимеразы II на повреждённом участке. У человека в TCR участвуют белки CSA и CSB (мутации в которых вызывают синдром Коккейна).

¶Механизм у эукариот

Процесс ЭРН у эукариот (включая человека) включает последовательность из более чем 30 белков и протекает в несколько этапов:

¶Распознавание повреждения

• В GGR: Белок XPC (в комплексе с RAD23B и центрином-2) связывается с участком ДНК, где повреждение вызывает локальное расплетение спирали. Распознавание не зависит от типа повреждения, а только от степени искажения структуры. Для некоторых типов повреждений, например, для циклобутановых пиримидиновых димеров (CPD), требуется дополнительный фактор — комплекс UV-DDB (DDB1-DDB2), который помогает XPC.
• В TCR: Остановившаяся РНК-полимераза II привлекает белки CSA и CSB. CSB рекрутирует нуклеазу XPG и факторы репарации, что приводит к отступлению полимеразы и доступности повреждённого участка для дальнейших этапов.

¶Инцизия (надрезание)

После распознавания на повреждённый участок собирается репарационный комплекс. Фактор транскрипции TFIIH (включающий субъединицы XPB и XPD с хеликазной активностью) раскручивает ДНК вокруг повреждения, создавая «пузырь» длиной 20–30 нуклеотидов. Затем две эндонуклеазы производят разрезы:

• XPF-ERCC1 (комплекс) — делает разрез по 5'-стороне от повреждения (на расстоянии 15–24 нуклеотидов).
• XPG — делает разрез по 3'-стороне от повреждения (на расстоянии 2–8 нуклеотидов).

¶Эксцизия и синтез

Образовавшийся фрагмент ДНК длиной 24–32 нуклеотида, содержащий повреждение, удаляется. Освободившаяся одноцепочечная брешь заполняется ДНК-полимеразой δ или ε (в комплексе с фактором скольжения PCNA и репликативным фактором C — RFC). Синтез ведётся по матрице неповреждённой комплементарной цепи.

¶Лигирование

Фермент ДНК-лигаза I (или ДНК-лигаза III в комплексе с XRCC1) сшивает вновь синтезированный фрагмент с существующей цепью ДНК, восстанавливая непрерывность двойной спирали.

¶Механизм у прокариот

У бактерий (на примере Escherichia coli) процесс ЭРН проще и включает три ключевых фермента, кодируемых генами uvrA, uvrB и uvrC:

1. Комплекс UvrA₂UvrB сканирует ДНК. UvrA распознаёт искажения спирали и передаёт UvrB к повреждению.
2. UvrA диссоциирует, а UvrB связывается с ДНК и раскручивает её вокруг повреждения.
3. UvrC связывается с комплексом UvrB-ДНК и производит два разреза: один на 7 нуклеотидов к 5'-стороне, другой на 3–4 нуклеотида к 3'-стороне от повреждения.
4. Фрагмент из 12–13 нуклеотидов удаляется хеликазой UvrD.
5. Брешь заполняется ДНК-полимеразой I, а лигирование осуществляется ДНК-лигазой.

¶Типы повреждений, устраняемых ЭРН

ЭРН способна удалять широкий спектр повреждений, которые вызывают значительные искажения двойной спирали ДНК. К ним относятся:

• Фотопродукты УФ-излучения: циклобутановые пиримидиновые димеры (CPD) и (6-4)-фотопродукты.
• Крупные аддукты: продукты присоединения полициклических ароматических углеводородов (например, бенз[a]пирен), афлатоксина B1, иприта, цисплатина.
• Сшивки ДНК: межцепочечные (ICL) и внутрицепочечные сшивки, вызванные некоторыми химиотерапевтическими агентами (например, митомицином C).
• Окислительные повреждения: некоторые объёмные окисленные основания, такие как 8-оксогуанин, могут быть удалены ЭРН, хотя в основном они репарируются BER.

¶Клиническое значение (заболевания человека)

Нарушения в генах, кодирующих белки ЭРН, приводят к развитию редких, но тяжёлых аутосомно-рецессивных заболеваний:

• Пигментная ксеродерма (Xeroderma Pigmentosum, XP): Характеризуется крайней чувствительностью к солнечному свету, высокой частотой рака кожи (в том числе меланомы) и преждевременным старением кожи. Вызвана мутациями в генах XPA, XPB, XPC, XPD, XPE, XPF или XPG. У некоторых пациентов с XP также наблюдаются неврологические нарушения.
• Синдром Коккейна (Cockayne Syndrome, CS): Проявляется задержкой роста, микроцефалией, фотосенсибилизацией, умственной отсталостью и преждевременным старением. Вызван мутациями в генах CSA (ERCC8) или CSB (ERCC6), нарушающими TCR. В отличие от XP, при CS не повышается риск рака кожи.
• Трихотиодистрофия (Trichothiodystrophy, TTD): Характеризуется ломкими волосами (из-за дефицита серы), ихтиозом, задержкой развития и фотосенсибилизацией. Вызвана мутациями в генах XPB, XPD или TTDA (GTF2H5), которые кодируют субъединицы фактора TFIIH. При TTD, как и при CS, риск рака не повышен.
• Синдром Фанкони (Fanconi Anemia, FA): Хотя основным дефектом при FA является репарация межцепочечных сшивок, некоторые белки ЭРН (например, XPF-ERCC1) участвуют в этом процессе, поэтому мутации в них могут приводить к фенотипу, напоминающему FA.

¶Эволюционная консервативность

Механизм ЭРН является одним из наиболее консервативных путей репарации ДНК. Ключевые белки, такие как хеликазы (XPB, XPD), нуклеазы (XPG, XPF) и факторы распознавания (XPC), имеют гомологи у всех доменов жизни: бактерий, архей и эукариот. У бактерий основными белками являются UvrA, UvrB и UvrC, у архей — система, близкая к эукариотической, но с некоторыми упрощениями. Эта консервативность подчёркивает фундаментальную важность ЭРН для поддержания стабильности генома.

¶Методы исследования

Для изучения ЭРН используются различные биохимические и клеточные методы:

• Анализ эксцизионной активности in vitro: Использование очищенных белков и радиоактивно меченых олигонуклеотидов с определёнными повреждениями для отслеживания вырезания фрагмента.
• Клеточные линии: Использование фибробластов пациентов с мутациями в генах ЭРН для оценки чувствительности к УФ-излучению и способности к репарации.
• Комета-анализ (щелочной вариант): Позволяет оценить количество разрывов ДНК, образующихся в процессе репарации.
• Иммунофлуоресценция: Визуализация рекрутирования белков ЭРН (например, XPC, XPA) к участкам повреждений, индуцированным лазером.

¶Источники

1. Sancar, A. (2016). Mechanisms of DNA Repair by Photolyase and Excision Nuclease (Nobel Lecture). Angewandte Chemie International Edition, 55(30), 8502–8527.
2. Friedberg, E. C., Walker, G. C., Siede, W., Wood, R. D., Schultz, R. A., & Ellenberger, T. (2006). DNA Repair and Mutagenesis (2nd ed.). ASM Press.
3. Schärer, O. D. (2013). Nucleotide excision repair in eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 5(10), a012609.
4. Lehmann, A. R. (2011). DNA repair-deficient diseases, xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and trichothiodystrophy. Biochimie, 93(1), 1–10.
5. Kisker, C., Kuper, J., & Van Houten, B. (2013). Prokaryotic nucleotide excision repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 5(3), a012591.
6. Wood, R. D. (1997). Nucleotide excision repair in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry, 272(38), 23465–23468.