Гель-электрофорез

Гель-электрофорез — это метод разделения смеси макромолекул (нуклеиновых кислот, белков, их фрагментов) в геле под действием электрического поля. Является одним из основных инструментов молекулярной биологии, биохимии, генетики и медицинской диагностики. Метод основан на различной электрофоретической подвижности заряженных частиц в пористой среде геля, которая зависит от их размера, формы и заряда.

История

Основы метода были заложены в 1930-х годах шведским биохимиком Арне Тизелиусом, который разработал метод свободного электрофореза и получил за это Нобелевскую премию по химии в 1948 году. Однако широкое распространение гель-электрофорез получил в 1960–1970-х годах после внедрения в практику гелей на основе агарозы и полиакриламида.

В 1975 году британский биохимик Фредерик Сэнгер разработал метод секвенирования ДНК с использованием полиакриламидного гель-электрофореза, за что получил вторую Нобелевскую премию. В 1977 году американский учёный Эдвард Саузерн предложил метод переноса фрагментов ДНК из геля на мембрану (Саузерн-блоттинг), что позволило проводить гибридизационный анализ. В 1980-х годах появился метод капиллярного электрофореза, а в 1990-х — методы автоматизированного электрофореза в микрожидкостных чипах.

Принцип метода

Гель-электрофорез основан на двух ключевых явлениях: электрофоретической подвижности заряженных частиц в электрическом поле и ситовом эффекте пористой среды геля.

Электрофоретическая подвижность

Заряженные молекулы (ДНК, РНК, белки) в электрическом поле движутся к противоположно заряженному электроду. Скорость движения (электрофоретическая подвижность) определяется по формуле:

\[ \mu = \frac{q}{6\pi\eta r} \]

где \( \mu \) — подвижность, \( q \) — заряд молекулы, \( \eta \) — вязкость среды, \( r \) — радиус молекулы. Для ДНК и РНК, имеющих отрицательный заряд фосфатного остова, движение происходит к аноду (положительному электроду). Белки, в зависимости от pH буфера, могут нести как положительный, так и отрицательный заряд.

Ситовой эффект

Гель представляет собой трёхмерную сетку полимерных цепей с порами определённого размера. Молекулы, размер которых превышает размер пор, не могут проникнуть в гель и остаются на старте. Молекулы меньшего размера проходят через поры, причём чем меньше молекула, тем быстрее она движется. Таким образом, гель действует как молекулярное сито, разделяя молекулы по размеру.

Виды гель-электрофореза

По типу геля

Агарозный гель-электрофорез — используется для разделения нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) длиной от 100 пар нуклеотидов (п.н.) до 50 000 п.н. Агароза — полисахарид, получаемый из красных водорослей. Концентрация агарозы в геле (от 0,5% до 3%) определяет размер пор: чем выше концентрация, тем меньше поры и тем лучше разделяются короткие фрагменты. Гели заливаются в горизонтальные камеры.

Полиакриламидный гель-электрофорез (ПААГ) — используется для разделения белков и коротких фрагментов нуклеиновых кислот (до 1000 п.н.). Полиакриламид образуется при полимеризации акриламида и сшивающего агента (бис-акриламида). Размер пор регулируется общей концентрацией мономеров (T) и степенью сшивки (C). ПААГ-гели обладают более высокой разрешающей способностью, чем агарозные. Гели заливаются в вертикальные камеры.

По условиям денатурации

Нативный (неденатурирующий) электрофорез — проводится в условиях, сохраняющих нативную структуру молекул. Используется для анализа белковых комплексов, ферментативной активности, разделения нативных форм ДНК (например, суперскрученной и линейной).

Денатурирующий электрофорез — проводится в присутствии денатурирующих агентов. Для нуклеиновых кислот используется формальдегид или мочевина, для белков — додецилсульфат натрия (SDS). SDS-ПААГ-электрофорез (SDS-PAGE) является стандартным методом разделения белков по молекулярной массе, так как SDS маскирует собственный заряд белка и придаёт всем белкам одинаковое отношение заряд/масса.

По направлению

Горизонтальный электрофорез — гель заливается в горизонтальную камеру, наиболее распространён для агарозных гелей.

Вертикальный электрофорез — гель заливается между двумя стеклянными пластинами, используется для ПААГ-гелей.

Оборудование и материалы

Основные компоненты

• Электрофоретическая камера — ёмкость с буферным раствором, в которой размещается гель и электроды. Камеры бывают горизонтальные и вертикальные.
• Источник питания — обеспечивает постоянное напряжение (обычно 50–300 В) или постоянный ток (до 500 мА).
• Гель — агарозный или полиакриламидный.
• Буферный раствор — поддерживает pH и ионную силу. Для ДНК-электрофореза чаще всего используется TAE (трис-ацетат-ЭДТА) или TBE (трис-борат-ЭДТА). Для белкового электрофореза — трис-глициновый буфер.
• Образцы — смесь разделяемых молекул, смешанная с буфером для нанесения (содержит краситель, глицерин или сахарозу для плотности, и часто денатурирующий агент).
• Маркер молекулярной массы (ДНК-маркер, белковый маркер) — смесь фрагментов известного размера, наносимая в отдельную дорожку для калибровки.
• Краситель — для визуализации разделённых молекул. Для ДНК чаще всего используется бромистый этидий (интеркалирующий краситель, флуоресцирующий в УФ-свете) или более безопасные аналоги (SYBR Safe, GelRed). Для белков — Кумасси бриллиантовый синий, серебряное окрашивание, флуоресцентные красители.

Процедура проведения

1. Приготовление геля: агароза или полиакриламидная смесь нагревается, заливается в форму с гребёнкой для формирования лунок.
2. Полимеризация: гель застывает (агароза — при охлаждении, ПААГ — при добавлении инициаторов полимеризации).
3. Загрузка образцов: образцы смешиваются с буфером для нанесения и вносятся в лунки.
4. Электрофорез: камера подключается к источнику питания, молекулы движутся через гель в течение определённого времени (от 30 минут до нескольких часов).
5. Визуализация: гель окрашивается или просматривается в УФ-свете (для флуоресцентных красителей), фотографируется.
6. Анализ: размер фрагментов определяется по калибровочной кривой, построенной по маркеру молекулярной массы.

Применение

В молекулярной биологии и генетике

• Анализ ПЦР-продуктов: проверка наличия и размера амплифицированных фрагментов ДНК.
• Рестрикционный анализ: разделение фрагментов ДНК после обработки рестриктазами для картирования генов.
• Секвенирование ДНК: классический метод Сэнгера использует денатурирующий ПААГ-электрофорез для разделения продуктов секвенирующей реакции.
• Генотипирование: выявление полиморфизмов длины рестрикционных фрагментов (RFLP), анализ микросателлитов.
• Электрофоретический анализ РНК: оценка целостности и размера РНК (например, в Northern-блоттинге).

В биохимии и протеомике

• SDS-PAGE: определение молекулярной массы белков, проверка чистоты препарата.
• Двумерный электрофорез (2D-электрофорез): разделение белков по изоэлектрической точке (первое направление) и по молекулярной массе (второе направление). Используется для протеомного анализа.
• Иммуноблоттинг (Western-блоттинг): перенос белков из геля на мембрану с последующей детекцией специфическими антителами.
• Анализ белковых комплексов: нативный электрофорез для изучения олигомерных белков.

В медицине и диагностике

• Диагностика наследственных заболеваний: выявление мутаций, делеций, инсерций (например, муковисцидоз, серповидноклеточная анемия).
• Генетическая идентификация: ДНК-фингерпринтинг, установление родства, криминалистическая экспертиза.
• Диагностика инфекционных заболеваний: обнаружение ДНК или РНК патогенов (например, SARS-CoV-2, ВИЧ, гепатит C) после ПЦР.
• Анализ белков сыворотки крови: электрофорез белков сыворотки (протеинограмма) используется для диагностики множественной миеломы, воспалительных процессов, заболеваний печени.

В фармацевтике и биотехнологии

• Контроль качества: проверка чистоты и целостности рекомбинантных белков, плазмидной ДНК, вакцин.
• Разработка лекарств: анализ взаимодействия лекарственных средств с ДНК или белками.

Преимущества и недостатки

Преимущества

• Простота и доступность: оборудование относительно недорогое, методика легко воспроизводится.
• Высокая разрешающая способность: ПААГ-электрофорез позволяет разделять молекулы, различающиеся по размеру на 1–2 нуклеотида (для ДНК) или на 1–2 кДа (для белков).
• Количественный анализ: интенсивность окрашивания полос пропорциональна количеству вещества.
• Возможность последующего анализа: полосы можно вырезать из геля и использовать для экстракции ДНК или белков, секвенирования, масс-спектрометрии.

Недостатки

• Трудоёмкость: приготовление гелей, окрашивание, фотографирование требуют времени и ручного труда.
• Ограниченный диапазон разделения: агарозные гели плохо разделяют короткие фрагменты (<100 п.н.), ПААГ-гели — длинные (>1000 п.н.).
• Токсичность реагентов: акриламид (нейротоксин), бромистый этидий (мутаген) требуют осторожного обращения.
• Полуколичественный характер: точное определение количества вещества требует дополнительных методов (денситометрия, флуориметрия).
• Зависимость от условий: температура, ионная сила буфера, напряжение влияют на качество разделения.

Современные модификации

• Капиллярный электрофорез: разделение в тонком капилляре (диаметр 25–100 мкм), заполненном гелем или буфером. Обеспечивает высокую скорость, автоматизацию, количественный анализ с флуоресцентной детекцией. Используется в секвенаторах ДНК и анализаторах фрагментов.
• Микрофлюидный электрофорез (Lab-on-a-chip): миниатюризированные чипы с микрофлюидными каналами, позволяющие проводить электрофорез за секунды-минуты с использованием нанолитровых объёмов образцов. Пример — система Bioanalyzer (Agilent).
• Пульс-электрофорез (PFGE): метод, в котором направление электрического поля периодически меняется, что позволяет разделять очень крупные молекулы ДНК (до 10 Мб). Используется для типирования бактерий, анализа хромосом.
• Градиентный электрофорез: использование геля с градиентом концентрации (например, денатурирующий градиентный гель-электрофорез, DGGE) для разделения фрагментов ДНК одинакового размера, но различающихся по последовательности (температуре плавления).

Источники

• Sambrook J., Russell D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. — 3rd ed. — Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
• Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. — 1970. — Vol. 227, № 5259. — P. 680–685.
• Southern E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // Journal of Molecular Biology. — 1975. — Vol. 98, № 3. — P. 503–517.
• Tiselius A. A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures // Transactions of the Faraday Society. — 1937. — Vol. 33. — P. 524–531.
• Анализ нуклеиновых кислот: методы и протоколы / под ред. А. А. Крылова. — М.: Бином, 2015.
• Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование. — М.: Наука, 1981.