Метод Сэнгера

Метод Сэнгера — это метод определения первичной структуры (последовательности аминокислот) белков, разработанный британским биохимиком Фредериком Сэнгером в 1940-х — 1950-х годах. Метод основан на химической модификации N-концевых аминокислот полипептидной цепи с помощью 1-фтор-2,4-динитробензола (реактив Сэнгера, или DNFB) с последующим кислотным гидролизом и идентификацией полученных динитрофенильных производных аминокислот. Этот метод стал первым в истории способом, позволившим полностью расшифровать аминокислотную последовательность белка, и принёс Сэнгеру Нобелевскую премию по химии в 1958 году.

История разработки

До середины XX века химическая структура белков оставалась предметом дискуссий. Существовали две основные гипотезы: «коллоидная» теория, согласно которой белки представляют собой нерегулярные агрегаты молекул, и «полипептидная» теория, утверждавшая, что белки построены из линейных цепочек аминокислот, соединённых пептидными связями. Фредерик Сэнгер, работавший в Кембриджском университете, поставил целью экспериментально подтвердить полипептидную модель и разработать методы анализа последовательностей.

В 1945 году Сэнгер предложил использовать 1-фтор-2,4-динитробензол (DNFB) для мечения N-концевых аминокислот. DNFB реагирует с первичной аминогруппой N-концевой аминокислоты, образуя стабильное динитрофенильное (DNP) производное. После полного кислотного гидролиза белка пептидные связи разрушаются, а DNP-связь сохраняется, что позволяет выделить и идентифицировать меченую аминокислоту. В 1945—1946 годах Сэнгер применил этот метод к инсулину и показал, что он содержит две N-концевые аминокислоты — фенилаланин и глицин, что свидетельствовало о наличии двух полипептидных цепей (A и B).

В 1951—1955 годах Сэнгер и его коллеги (в частности, Ханс Туппи) усовершенствовали метод, добавив этапы частичного гидролиза (с использованием соляной кислоты или ферментов) и хроматографического разделения полученных пептидных фрагментов. Это позволило не только определить N-концевые аминокислоты, но и восстановить полную последовательность всей молекулы. В 1955 году Сэнгер опубликовал полную аминокислотную последовательность инсулина быка — первый белок, структура которого была полностью расшифрована. За эту работу он был удостоен Нобелевской премии по химии в 1958 году.

Принцип метода

Метод Сэнгера включает несколько последовательных этапов:

1. Модификация N-концевых аминокислот. Белок обрабатывают 1-фтор-2,4-динитробензолом (DNFB) в слабощелочной среде. DNFB реагирует с α-аминогруппой N-концевой аминокислоты, образуя DNP-производное. Реакция идёт также с ε-аминогруппами лизина, но эти побочные продукты не мешают анализу N-концов.

1. Кислотный гидролиз. Модифицированный белок подвергают полному гидролизу в 6 М соляной кислоте при 110°C в течение 18–24 часов. При этом все пептидные связи разрушаются, а DNP-связь между N-концевой аминокислотой и DNFB остаётся интактной.

1. Экстракция и идентификация DNP-аминокислот. DNP-производные аминокислот (жёлтого цвета) экстрагируют органическим растворителем (например, этилацетатом) и разделяют с помощью хроматографии на бумаге или тонкослойной хроматографии. Каждая DNP-аминокислота имеет характерную подвижность (Rf), что позволяет идентифицировать её сравнением с эталонными образцами.

1. Определение N-концевых аминокислот. Для белков, состоящих из одной полипептидной цепи, определяется одна N-концевая аминокислота. Для белков с несколькими цепями (например, инсулин) — несколько.

Для определения полной последовательности (а не только N-конца) метод был расширен:

• Частичный гидролиз. Белок гидролизуют не полностью, а частично (например, с помощью ферментов — трипсина, химотрипсина, пепсина или соляной кислоты в течение короткого времени). Получается смесь пептидных фрагментов разной длины.
• Разделение пептидов. Фрагменты разделяют с помощью хроматографии или электрофореза.
• Определение N-концов каждого пептида. Каждый пептид обрабатывают DNFB, гидролизуют и идентифицируют DNP-аминокислоту.
• Сборка последовательности. Путём перекрывания последовательностей разных пептидных фрагментов (полученных при разных условиях гидролиза) восстанавливают полную аминокислотную последовательность исходного белка.

Применение

Метод Сэнгера сыграл ключевую роль в становлении молекулярной биологии и биохимии. Его основные применения:

• Расшифровка первичных структур белков. С помощью метода Сэнгера были определены последовательности многих белков, включая инсулин, рибонуклеазу (первый фермент, структура которого была расшифрована в 1960-х годах), лизоцим, гемоглобин и другие.
• Изучение структуры активных центров ферментов. Метод позволял идентифицировать аминокислоты, участвующие в катализе, путём мечения активных центров химическими реагентами.
• Сравнительная эволюционная биохимия. Сравнение аминокислотных последовательностей гомологичных белков у разных видов позволило изучать эволюционные связи и строить филогенетические деревья.
• Разработка методов секвенирования ДНК. Принципы, заложенные в методе Сэнгера (использование специфических реагентов для мечения концов, фрагментация, разделение и сборка), были впоследствии применены Фредериком Сэнгером при разработке метода секвенирования ДНК (метод «обрыва цепи»), за который он получил вторую Нобелевскую премию по химии в 1980 году.

Ограничения

Метод Сэнгера имел ряд существенных ограничений:

• Трудоёмкость. Расшифровка последовательности даже небольшого белка (например, инсулина, 51 аминокислота) занимала несколько лет.
• Необходимость больших количеств белка. Для анализа требовались миллиграммы чистого белка, что было проблематично для редких или труднодоступных белков.
• Неприменимость к длинным белкам. Полное секвенирование белков длиной более 100–200 аминокислот было крайне сложным из-за большого числа пептидных фрагментов.
• Потеря информации при гидролизе. Некоторые аминокислоты (например, триптофан, цистеин) разрушались при кислотном гидролизе, что требовало дополнительных методов анализа.
• Невозможность определения модифицированных аминокислот. Метод не позволял различать посттрансляционные модификации (фосфорилирование, гликозилирование и т.д.).

Современное значение

В настоящее время метод Сэнгера в его первоначальном виде практически не используется для секвенирования белков. На смену ему пришли более эффективные методы:

• Эдмановская деградация (метод Эдмана) — циклический процесс, позволяющий последовательно отщеплять и идентифицировать N-концевые аминокислоты без полного гидролиза. Этот метод был разработан в 1950-х годах и стал основным для секвенирования белков до появления масс-спектрометрии.
• Масс-спектрометрия белков (MALDI-TOF, ESI-MS/MS) — современный метод, позволяющий определять аминокислотные последовательности с высокой точностью и скоростью, а также идентифицировать посттрансляционные модификации.
• Секвенирование ДНК — поскольку аминокислотная последовательность белка кодируется геном, современная биоинформатика часто определяет структуру белка путём секвенирования соответствующего гена и трансляции нуклеотидной последовательности.

Тем не менее, метод Сэнгера остаётся исторически важной вехой в развитии биохимии. Он впервые доказал, что белки имеют строго определённую, уникальную аминокислотную последовательность, а не являются нерегулярными полимерами. Этот метод заложил основы для понимания связи между структурой и функцией белков и открыл путь к молекулярной биологии.

Интересные факты

• Фредерик Сэнгер — один из четырёх учёных в истории, получивших две Нобелевские премии (в 1958 и 1980 годах), и единственный, кто получил обе премии по химии.
• Для расшифровки последовательности инсулина Сэнгер использовал около 10 мг чистого белка, выделенного из поджелудочных желез быков.
• Метод Сэнгера был впервые описан в статье «The free amino groups of insulin» (1945), опубликованной в Biochemical Journal.
• Сэнгер отказался от рыцарского звания, но принял Орден Заслуг (Order of Merit) — одну из высших наград Великобритании.

Источники

• Sanger F. (1945). The free amino groups of insulin. Biochemical Journal, 39(5), 507–515.
• Sanger F., Tuppy H. (1951). The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin. Biochemical Journal, 49(4), 463–481.
• Sanger F. (1959). Chemistry of insulin. Science, 129(3359), 1340–1344.
• Stretton A.O.W. (2002). The first sequence: Fred Sanger and insulin. Genetics, 162(2), 527–532.
• Нобелевская лекция Ф. Сэнгера (1958). «The chemistry of insulin».