Хромато-масс-спектрометрия

Хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС, ВЭЖХ-МС, хромато-масс-спектрометрия) — это комбинированный аналитический метод, объединяющий физическое разделение компонентов сложной смеси с помощью хроматографии и их последующую идентификацию и количественное определение методом масс-спектрометрии. Метод позволяет одновременно разделять, идентифицировать и измерять концентрации веществ, присутствующих в образце в чрезвычайно малых количествах (вплоть до пикограммов на литр), что делает его одним из наиболее мощных инструментов в современной аналитической химии.

История

Развитие хромато-масс-спектрометрии стало возможным после изобретения газовой хроматографии (ГХ) в 1950-х годах и совершенствования масс-спектрометров. Первые успешные попытки соединения газового хроматографа с масс-спектрометром были предприняты в конце 1950-х годов Р. Голке и Дж. Маклафферти. Ключевой проблемой было несовместимость атмосферного давления на выходе из хроматографа и высокого вакуума, необходимого для работы масс-спектрометра. Решением стало создание эффективных интерфейсов, таких как сепараторы Джетта и мембранные сепараторы, которые удаляли большую часть газа-носителя, не теряя анализируемые вещества.

В 1970-х годах началось промышленное производство коммерческих ГХ-МС-систем. Развитие компьютерной техники позволило автоматизировать сбор и обработку данных, а также создавать библиотеки масс-спектров для идентификации неизвестных соединений. В 1980-х годах получила развитие жидкостная хромато-масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС), где в качестве интерфейса стали использовать электроспрей (ESI) и химическую ионизацию при атмосферном давлении (APCI). Это открыло возможности для анализа полярных, нелетучих и термолабильных соединений, таких как белки, пептиды и метаболиты. К началу XXI века хромато-масс-спектрометрия стала стандартом в фармацевтике, экологии, криминалистике и клинической диагностике.

Принцип метода

Хромато-масс-спектрометрия объединяет два этапа. На первом этапе — хроматографическом разделении — смесь веществ в потоке подвижной фазы (газа или жидкости) пропускается через колонку, заполненную неподвижной фазой. Компоненты смеси взаимодействуют с неподвижной фазой с разной силой, поэтому они выходят из колонки в разное время (время удерживания). На втором этапе — масс-спектрометрическом анализе — каждое вещество, поступившее в масс-спектрометр, ионизируется, и образовавшиеся ионы разделяются по отношению массы к заряду (m/z). Полученный масс-спектр (график зависимости интенсивности ионного тока от m/z) является уникальным для каждого химического соединения, что позволяет его идентифицировать.

Хроматографическое разделение

В зависимости от природы подвижной фазы различают газовую хромато-масс-спектрометрию (ГХ-МС) и жидкостную хромато-масс-спектрометрию (ВЭЖХ-МС или ЖХ-МС). В ГХ-МС подвижной фазой служит инертный газ (гелий, азот), а разделение происходит в капиллярной колонке с нанесённой неподвижной фазой. Метод применим для летучих и термостабильных соединений. В ВЭЖХ-МС подвижной фазой является жидкость (растворитель или смесь растворителей), а колонка заполнена сорбентом. Этот метод позволяет анализировать нелетучие, полярные и высокомолекулярные соединения.

Масс-спектрометрический анализ

После выхода из колонки вещество попадает в источник ионизации. Наиболее распространённые типы ионизации:

• Электронная ионизация (EI) — используется в ГХ-МС. Молекулы бомбардируются электронами с энергией 70 эВ, что приводит к образованию молекулярных ионов и их фрагментов. Масс-спектры EI хорошо воспроизводимы и представлены в библиотеках.
• Химическая ионизация (CI) — более мягкий метод, при котором ионизация происходит за счёт реакций с ионами реагентного газа. Позволяет получить преимущественно молекулярный ион.
• Электроспрей (ESI) — применяется в ВЭЖХ-МС. Жидкость распыляется в электрическом поле, образуя заряженные капли. После испарения растворителя остаются многозарядные ионы, что особенно важно для анализа белков и пептидов.
• Химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI) — используется для менее полярных соединений, чем ESI.

После ионизации ионы разделяются масс-анализатором. Основные типы масс-анализаторов:

• Квадрупольный — наиболее распространённый, простой и надёжный. Позволяет сканировать диапазон масс или работать в режиме селективного мониторинга ионов (SIM) для повышения чувствительности.
• Времяпролётный (TOF) — измеряет время пролёта ионов до детектора. Обеспечивает высокое разрешение и точность определения массы.
• Ионная ловушка — позволяет проводить многоступенчатую масс-спектрометрию (МС/МС) для структурного анализа.
• Орбитальная ловушка (Orbitrap) — обеспечивает сверхвысокое разрешение и точность, используется для метаболомики и протеомики.

Классификация

Хромато-масс-спектрометрию классифицируют по типу хроматографического метода и типу масс-анализатора. Основные виды:

• Газовая хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС) — для летучих и термостабильных соединений.
• Жидкостная хромато-масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС или ЖХ-МС) — для нелетучих, полярных и термолабильных соединений.
• Тандемная масс-спектрометрия (МС/МС) — метод, при котором ионы, отобранные по массе, дополнительно фрагментируются, и анализируются их фрагменты. Позволяет значительно повысить селективность и чувствительность.
• Высокоэффективная жидкостная хромато-масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС/МС) — сочетание ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией, наиболее распространённый вариант для количественного анализа.

Применение

Хромато-масс-спектрометрия широко используется в различных областях науки и промышленности.

Фармацевтика и биохимия

• Анализ лекарственных средств и их метаболитов в биологических жидкостях (фармакокинетика, токсикокинетика).
• Контроль качества и стабильности фармацевтических субстанций и готовых лекарственных форм.
• Идентификация и количественное определение белков, пептидов, липидов и других биомолекул (протеомика, метаболомика, липидомика).

Экология и контроль окружающей среды

• Определение загрязнителей в воде, воздухе, почве и донных отложениях: пестицидов, полихлорированных бифенилов (ПХБ), полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), диоксинов, фуранов.
• Мониторинг стойких органических загрязнителей (СОЗ) в рамках международных конвенций.

Пищевая промышленность

• Контроль безопасности продуктов питания: определение остаточных количеств пестицидов, ветеринарных препаратов, микотоксинов, пищевых добавок и контаминантов.
• Аутентификация продуктов (например, определение подлинности мёда, вина, оливкового масла по составу ароматических соединений).

Криминалистика и судебная экспертиза

• Анализ наркотических и психотропных веществ, их метаболитов и прекурсоров.
• Идентификация взрывчатых веществ, ядов, токсинов.
• Анализ следов выстрела, горюче-смазочных материалов, красителей.

Клиническая диагностика

• Скрининг наследственных нарушений обмена веществ (например, ацидемий, аминоацидопатий) у новорождённых с помощью тандемной масс-спектрометрии.
• Определение концентрации лекарственных препаратов в крови (терапевтический лекарственный мониторинг).
• Диагностика отравлений и токсикологических состояний.

Нефтехимия и органическая химия

• Анализ состава нефти, нефтепродуктов, природного газа.
• Идентификация продуктов химических реакций, катализаторов, примесей.

Преимущества и недостатки

Преимущества

• Высокая чувствительность — позволяет обнаруживать вещества на уровне следов (нг/л, пг/л).
• Высокая селективность — комбинация хроматографического времени удерживания и масс-спектра обеспечивает надёжную идентификацию.
• Универсальность — применим для широкого круга соединений (от газов до белков).
• Количественный анализ — возможность точного определения концентраций с использованием внутренних стандартов.
• Автоматизация — современные системы позволяют проводить анализ в автоматическом режиме с высокой производительностью.

Недостатки

• Высокая стоимость оборудования — масс-спектрометры, особенно высокого разрешения, дороги в приобретении и обслуживании.
• Сложность эксплуатации — требует квалифицированного персонала для настройки, калибровки и интерпретации данных.
• Ограничения по летучести и термостабильности — для ГХ-МС требуется, чтобы вещества были летучими и не разлагались при нагревании.
• Матричные эффекты — в ВЭЖХ-МС возможно подавление или усиление ионизации из-за присутствия других компонентов образца.
• Необходимость пробоподготовки — многие образцы требуют экстракции, очистки и концентрирования перед анализом.

Интересные факты

• Первая коммерческая ГХ-МС-система была выпущена компанией Hewlett-Packard (ныне Agilent Technologies) в 1970 году.
• Библиотека масс-спектров Национального института стандартов и технологий (NIST) содержит более 300 000 спектров и используется для идентификации неизвестных соединений.
• В 2003 году за разработку методов ионизации для масс-спектрометрии биологических макромолекул (включая электроспрей) была присуждена Нобелевская премия по химии (Дж. Фенн, К. Танака).
• Тандемная масс-спектрометрия (МС/МС) используется для скрининга новорождённых на более чем 50 наследственных заболеваний в рамках программ неонатального скрининга во многих странах, включая Россию.

Источники

• Хоффманн Э., Штрообан В. Хромато-масс-спектрометрия: практическое руководство. — М.: Техносфера, 2008.
• Карас М., Хилленкамп Ф. Аналитическая масс-спектрометрия. — М.: Мир, 1992.
• Национальный институт стандартов и технологий (NIST). Библиотека масс-спектров.
• Российский государственный стандарт ГОСТ Р 53217-2008 (ИСО 10382:2002) «Качество почвы. Определение содержания хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов. Газохроматографический метод с масс-спектрометрическим детектированием».
• Статья «Хромато-масс-спектрометрия» в Большой российской энциклопедии (2017).