Инвертированные концевые повторы¶

Инвертированные концевые повторы (англ. inverted terminal repeats, ITR) — это короткие нуклеотидные последовательности, расположенные на концах (терминальных участках) молекулы нуклеиновой кислоты, которые при прочтении в противоположных направлениях (5'→3' и 3'→5') являются комплементарными друг другу. Благодаря такой структуре одноцепочечные участки ITR могут спариваться между собой, образуя двуцепочечный «стебель» (шпильку) или крестообразную структуру (палиндром). Инвертированные повторы являются важным элементом генетики вирусов, мобильных генетических элементов и некоторых плазмид.

¶Структура и свойства

Инвертированный концевой повтор представляет собой палиндромную последовательность, расположенную на обоих концах генома. Если последовательность на левом конце (L-ITR) имеет вид 5'-AATTCCGG-3', то на правом конце (R-ITR) она будет выглядеть как 5'-CCGGAATT-3' (комплементарная и обратная). При денатурации (разделении цепей) ДНК такие участки могут образовывать внутримолекулярные двуцепочечные структуры — «шпильки» или «кресты».

Ключевые характеристики ITR:

• Длина: варьируется от десятков до нескольких сотен нуклеотидов (например, у аденоассоциированного вируса — 145 нуклеотидов, у транспозонов семейства Tc1/mariner — около 200–400 пар оснований).
• Консервативность: последовательности ITR высоко консервативны внутри одного вида, но сильно различаются между разными видами.
• Функциональная роль: ITR содержат сайты связывания для белков (например, репликазы, интегралы) и сигналы для начала репликации или упаковки генома.

¶Биологическая роль

¶Вирусные геномы

Наиболее изученным примером являются аденоассоциированные вирусы (AAV). Их геном представлен одноцепочечной ДНК, по краям которой расположены ITR длиной 145 нуклеотидов. Эти повторы образуют Т-образные шпилечные структуры, которые служат:

• ориджином (точкой начала) репликации;
• сигналом для упаковки генома в капсид;
• сайтом интеграции в геном клетки-хозяина (у дикого типа — в локус AAVS1 на 19-й хромосоме человека).

ITR также характерны для ретровирусов (в виде длинных концевых повторов, LTR, которые, однако, не являются инвертированными, а прямыми) и парвовирусов, где они формируют сложные вторичные структуры, необходимые для репликации по механизму «катящегося кольца».

¶Транспозоны

У ДНК-транспозонов (например, Ac/Ds у кукурузы, P-элемент у дрозофилы) инвертированные концевые повторы являются обязательным элементом. Транспозаза — фермент, катализирующий перемещение элемента, — узнаёт именно ITR, вырезает элемент из донорного локуса и вставляет его в новый сайт-мишень. Мутации в ITR приводят к потере мобильности транспозона.

¶Плазмиды и бактериофаги

Некоторые плазмиды и умеренные бактериофаги (например, фаг Mu) содержат ITR, которые участвуют в сайт-специфической рекомбинации и интеграции в хромосому бактерии.

¶Применение в биотехнологии

Инвертированные концевые повторы широко используются в генной инженерии:

1. Векторы на основе AAV: ITR являются единственными вирусными элементами, необходимыми для создания рекомбинантных векторов. В таких конструкциях между двумя ITR помещают терапевтический ген, а все вирусные гены (Rep, Cap) удаляют. Это обеспечивает безопасность и длительную экспрессию трансгена.

1. Транспозонные векторы (Sleeping Beauty, piggyBac): используются для стабильной интеграции трансгенов в геном клеток млекопитающих. ITR этих транспозонов фланкируют целевой ген, а транспозаза обеспечивает его встраивание.

1. CRISPR-системы: в некоторых модификациях донорных матриц для гомологичной рекомбинации применяют ITR для стабилизации одноцепочечных ДНК.

¶Методы обнаружения

Для поиска ITR в геномных последовательностях используют биоинформатические алгоритмы, такие как:

• Palindrome (EMBOSS) — поиск палиндромов;
• Inverted Repeats Finder (IRF) — специализированная программа для поиска инвертированных повторов с учётом возможных ошибок (мисматчей и гэпов);
• CRISPRCasFinder — для выявления повторов в CRISPR-кассетах.

Экспериментально структуру ITR подтверждают методом электронной микроскопии (визуализация шпилек), анализом плавления ДНК (изменение температуры денатурации) и ферментативным расщеплением S1-нуклеазой (специфичной к одноцепочечным участкам).

¶Интересные факты

• ITR аденоассоциированного вируса способны образовывать до трёх различных шпилечных структур (в зависимости от условий), что делает их уникальным объектом для изучения динамики вторичной структуры ДНК.
• У некоторых вирусов (например, вируса герпеса) ITR фланкируют внутренние повторы, образуя сложные тандемные массивы, которые участвуют в перестройках генома.
• Инвертированные повторы часто встречаются в регуляторных областях прокариотических генов, где они служат сайтами связывания репрессоров (например, в опероне триптофана E. coli).

¶Источники

• Самуилов В. Д., Олескин А. В. «Молекулярная биология: структура и функции нуклеиновых кислот».
• Патрушев Л. И. «Экспрессия генов».
• Muzyczka N., Berns K. I. «Adeno-associated virus (AAV) vectors» // Fields Virology, 2001.
• Ivics Z. et al. «Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish» // Cell, 1997.