Плазмиды

Плазмида — это внехромосомный, обычно кольцевой, реже линейный, молекулярный элемент генетического материала, способный к автономной репликации в клетке. Плазмиды представляют собой молекулы ДНК, которые существуют и реплицируются независимо от хромосомной ДНК клетки-хозяина. Они широко распространены среди бактерий, а также встречаются у архей и некоторых эукариот (например, у дрожжей). Плазмиды не являются обязательными для жизнедеятельности клетки в нормальных условиях, но часто несут гены, обеспечивающие селективные преимущества, такие как устойчивость к антибиотикам, способность к конъюгации или утилизации специфических субстратов.

История открытия

Первые наблюдения, указывающие на существование внехромосомных факторов наследственности, были сделаны в середине XX века. В 1952 году американские генетики Джошуа Ледерберг и Нортон Зиндер в ходе экспериментов с бактерией Salmonella typhimurium обнаружили явление трансдукции — переноса генетического материала с помощью бактериофагов. Однако термин «плазмида» был введён в научный обиход самим Ледербергом в 1952 году для обозначения любого внехромосомного наследственного фактора. Первоначально под это определение подпадали и бактериофаги, но впоследствии понятие сузилось до автономных репликонов, не являющихся вирусными.

В 1960-х годах, с развитием методов молекулярной биологии, началось систематическое изучение плазмид. Особое внимание привлекли R-плазмиды (факторы резистентности), несущие гены устойчивости к антибиотикам. Их распространение среди патогенных бактерий стало серьёзной проблемой здравоохранения. В 1970-х годах плазмиды стали ключевым инструментом генной инженерии: после открытия рестриктаз и лигаз их начали использовать как векторы для клонирования чужеродных генов. Первая рекомбинантная молекула ДНК была создана в 1973 году Стэнли Коэном и Гербертом Бойером с использованием плазмиды pSC101.

Строение и свойства

Плазмиды представляют собой двуцепочечные молекулы ДНК. Их размер варьируется в широких пределах — от нескольких сотен пар оснований (мелкие плазмиды) до более чем 1000 килобаз (мегаплазмиды). Для поддержания стабильного наследования плазмида должна содержать как минимум один ориджин репликации (точку начала репликации, ori), а также гены, контролирующие этот процесс.

Основные структурные элементы

Ориджин репликации — участок, с которого начинается синтез дочерней цепи ДНК. Определяет совместимость плазмиды с клеткой-хозяином и число копий.
Гены репликации — кодируют белки, необходимые для инициации и элонгации репликации (например, Rep-белки).
Маркерные гены — гены, придающие клетке-хозяину селективное преимущество (например, гены устойчивости к антибиотикам).
Участки для сайт-специфической рекомбинации — могут участвовать в интеграции плазмиды в хромосому.
Мобильные элементы — транспозоны, инсерционные последовательности, которые могут перемещаться внутри генома.

Копийность

Количество копий плазмиды на клетку (копийность) определяется типом ориджина репликации и регулируется клеточными механизмами. Различают:

Низкокопийные плазмиды (1–3 копии на клетку). Репликация строго контролируется, и плазмиды тщательно распределяются между дочерними клетками.
Высококопийные плазмиды (10–100 и более копий на клетку). Репликация менее строгая, что позволяет получать большое количество копий, что удобно для генной инженерии.

Несовместимость

Плазмиды, использующие один и тот же механизм репликации или распределения, не могут стабильно сосуществовать в одной клетке. Это явление называется несовместимостью. Плазмиды делят на группы несовместимости (Inc-группы), что важно для классификации и понимания их распространения.

Классификация плазмид

Плазмиды классифицируют по нескольким признакам: способности к конъюгации, спектру хозяев, функциям, которые они кодируют, и молекулярным особенностям.

По способности к конъюгативному переносу

Конъюгативные плазмиды — содержат набор генов (tra), необходимых для образования полового пиля и переноса ДНК от одной бактерии к другой. Примеры: F-плазмида (фактор фертильности) Escherichia coli, Ti-плазмида Agrobacterium tumefaciens.
Мобилизуемые плазмиды — не содержат полного набора генов конъюгации, но могут передаваться с помощью конъюгативной плазмиды, присутствующей в той же клетке.
Неконъюгативные плазмиды — не способны к самостоятельному переносу и не могут быть мобилизованы.

По спектру хозяев

Плазмиды с узким кругом хозяев — реплицируются только в одном виде или группе близкородственных бактерий.
Плазмиды с широким кругом хозяев — способны реплицироваться в различных таксономических группах бактерий (например, плазмиды групп IncP и IncQ).

По функциональному назначению

F-плазмиды (факторы фертильности) — обеспечивают конъюгацию. Классическая F-плазмида E. coli была открыта в 1940-х годах.
R-плазмиды (факторы резистентности) — несут гены устойчивости к антибиотикам, тяжелым металлам, бактерицидным веществам. Часто содержат транспозоны.
Col-плазмиды (бактериоциногенные) — кодируют синтез бактериоцинов (например, колицинов), подавляющих рост родственных бактерий.
Плазмиды вирулентности — содержат гены, усиливающие патогенность бактерий (например, токсины, адгезины, факторы инвазии). Пример: плазмиды энтеротоксигенных штаммов E. coli.
Плазмиды метаболизма — кодируют ферменты для утилизации необычных субстратов (например, толуола, нафталина, камфоры).
Ti-плазмиды (опухоль-индуцирующие) — обнаружены у Agrobacterium tumefaciens. Вызывают образование корончатых галлов у растений. Широко используются в генной инженерии растений.
Криптические плазмиды — плазмиды, функция которых не установлена.

Репликация и контроль

Репликация плазмид осуществляется с помощью клеточного аппарата репликации, но инициируется плазмидными белками. Механизмы контроля копийности включают:

РНК-антисмысловые регуляторы — короткие РНК, связывающиеся с мРНК репликаторных белков и блокирующие их трансляцию.
Итерационные последовательности — повторяющиеся участки ДНК, связывающие белок-репликатор и регулирующие его количество.
Контроль на уровне инициации — белок Rep связывается с ориджином, и его концентрация определяет частоту инициации.

Передача генетической информации

Плазмиды играют ключевую роль в горизонтальном переносе генов (ГПГ) у прокариот. Основные механизмы:

Конъюгация — прямой контакт клеток через пили. Конъюгативные плазмиды могут переносить не только себя, но и другие мобильные элементы, а также фрагменты хромосомной ДНК.
Трансформация — поглощение свободной плазмидной ДНК из окружающей среды. Возможна при наличии компетентности клетки.
Трансдукция — перенос плазмидной ДНК с помощью бактериофагов.

Применение в науке и биотехнологии

Плазмиды являются одним из основных инструментов молекулярной биологии и генной инженерии.

Векторы для клонирования

Искусственно сконструированные плазмиды (например, pBR322, pUC19) используются для клонирования фрагментов ДНК. Они содержат:

Полилинкер (множественный сайт клонирования) — участок с уникальными сайтами рестрикции.
Селективный маркер (например, ген устойчивости к ампициллину).
Ориджин репликации.

Экспрессионные векторы

Плазмиды, содержащие сильные промоторы (например, lac, T7), позволяют получать большие количества рекомбинантных белков в бактериях (чаще всего в E. coli).

Генная терапия

Плазмидные конструкции используются для доставки терапевтических генов в клетки человека. Вакцины на основе плазмидной ДНК (ДНК-вакцины) исследуются для защиты от инфекционных заболеваний и рака.

Создание трансгенных растений

Ti-плазмида Agrobacterium tumefaciens является основным вектором для введения чужеродных генов в геном двудольных растений. Метод агробактериальной трансформации широко применяется в сельском хозяйстве.

Белковая инженерия и метаболическая инженерия

Плазмиды используются для наработки мутантных белков, а также для введения генов ферментов в микроорганизмы с целью создания штаммов-продуцентов ценных веществ (аминокислот, витаминов, антибиотиков, биотоплива).