Клеточный сфероид

Клеточный сфероид — это трёхмерная агрегатная структура, образованная клетками (эукариотическими или прокариотическими), которые растут в виде компактного, приблизительно сферического кластера. В отличие от традиционных двумерных (монослойных) культур клеток, сфероиды моделируют более реалистичную микроокружающую среду, характерную для тканей живого организма: плотное межклеточное взаимодействие, градиенты питательных веществ, кислорода и метаболитов, а также наличие внеклеточного матрикса. Сфероиды широко используются в биомедицинских исследованиях, в частности в онкологии, токсикологии, регенеративной медицине и тканевой инженерии.

История

Первые упоминания о способности клеток формировать агрегаты в суспензии относятся к началу XX века. В 1907 году американский зоолог Генри Ван Питерс Уилсон (Henry Van Peters Wilson) продемонстрировал, что диссоциированные клетки губок могут самопроизвольно реорганизовываться в многоклеточные структуры. Однако систематическое изучение клеточных сфероидов как инструмента для биологии началось в 1970-х годах, когда были разработаны методы культивирования опухолевых клеток в виде сфероидов для изучения радиочувствительности и химиорезистентности.

В 1980-х годах Роберт Сазерленд (Robert Sutherland) и его коллеги ввели понятие «многоклеточный опухолевый сфероид» (multicellular tumor spheroid, MCTS), который стал стандартной моделью для изучения солидных опухолей. В последующие десятилетия технологии получения сфероидов совершенствовались: от простого культивирования на агарозных покрытиях до использования микрофлюидных чипов, ультранизкоприлипающих планшетов и биопринтеров. С начала 2000-х годов сфероиды активно применяются в регенеративной медицине, в частности для создания тканевых конструкций и органоидов.

Классификация

Клеточные сфероиды классифицируют по нескольким признакам: происхождению, способу получения, размеру и составу.

По происхождению клеток

• Опухолевые сфероиды — образуются из клеток злокачественных новообразований (например, линий MCF-7, HepG2, A549). Используются для моделирования роста опухоли, метастазирования и тестирования противораковых препаратов.
• Сфероиды из стволовых клеток — формируются из эмбриональных стволовых клеток, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) или мезенхимальных стволовых клеток. Применяются в регенеративной медицине и дифференцировке тканей.
• Гетеротипические сфероиды — состоят из двух или более типов клеток (например, опухолевых и фибробластов). Позволяют изучать межклеточные взаимодействия, ангиогенез и иммунный ответ.
• Бактериальные сфероиды — агрегаты бактерий, образующиеся в условиях ограниченного пространства или при стрессовых воздействиях. Используются в микробиологии для изучения биоплёнок и симбиотических сообществ.

По способу получения

• Жидкостная суспензия — клетки помещают в среду с низкой адгезией (например, на агарозное покрытие) и центрифугируют для ускорения агрегации.
• Метод висячей капли — капли клеточной суспензии подвешивают на крышке чашки Петри; под действием гравитации клетки собираются на дне капли.
• Микрофлюидные устройства — клетки пропускают через каналы с ловушками, где они агрегируются под контролем потока.
• Биопечать — сфероиды формируются послойно с помощью 3D-принтера, часто с использованием биочернил.
• Ультранизкоприлипающие планшеты — специализированные 96- или 384-луночные планшеты с покрытием, предотвращающим прикрепление клеток к стенкам.

По размеру

• Микросфероиды — диаметр менее 100 мкм; состоят из нескольких десятков клеток.
• Мезосфероиды — диаметр от 100 до 500 мкм; наиболее распространённый тип, демонстрирующий чёткое зонирование (пролиферативный слой, покоящийся слой, некротическое ядро).
• Макросфероиды — диаметр более 500 мкм; часто имеют центральный некроз из-за ограниченной диффузии кислорода.

Устройство и характеристики

Структура сфероида определяется диффузионными ограничениями. Внутри сфероида формируются три зоны:

1. Внешний слой (пролиферативная зона) — клетки активно делятся, получают достаточное количество кислорода и питательных веществ. Толщина слоя составляет 100–200 мкм.
2. Промежуточный слой (покоящаяся зона) — клетки находятся в состоянии G0/G1-фазы клеточного цикла, метаболическая активность снижена из-за гипоксии и дефицита глюкозы.
3. Центральное ядро (некротическая зона) — при диаметре сфероида более 400–500 мкм в центре возникает гипоксия и ацидоз, приводящие к гибели клеток. В опухолевых сфероидах это ядро моделирует некротические участки солидных опухолей.

Ключевые характеристики сфероидов, отличающие их от монослойных культур:

• Плотность клеток — высокая, до 10⁶ клеток/мм³.
• Градиенты — кислорода (от 20% на поверхности до 0% в центре), pH (от 7,4 до 6,5), глюкозы, лактата.
• Внеклеточный матрикс — клетки секретируют коллаген, фибронектин, ламинин, что обеспечивает механическую стабильность.
• Межклеточные контакты — формируются плотные, адгезивные и щелевые контакты (например, E-кадгерин, десмосомы).

Применение

Онкология

Сфероиды являются стандартной моделью для изучения солидных опухолей. Они позволяют оценивать:

• Химиорезистентность — клетки в центре сфероида менее чувствительны к препаратам из-за ограниченной диффузии и гипоксии.
• Радиочувствительность — гипоксические клетки проявляют большую устойчивость к ионизирующему излучению.
• Метастатический потенциал — сфероиды могут инвазировать в окружающий матрикс, имитируя процесс метастазирования.

Токсикология

Сфероиды используются для скрининга лекарственных средств и химических веществ на гепатотоксичность, нейротоксичность и кардиотоксичность. Например, сфероиды из гепатоцитов (HepG2) позволяют оценивать метаболизм ксенобиотиков и их влияние на печень.

Регенеративная медицина

Сфероиды из стволовых клеток применяются для:

• Тканевой инженерии — сфероиды служат строительными блоками для создания трёхмерных конструкций (например, костной, хрящевой, сердечной ткани).
• Терапии — трансплантация сфероидов улучшает выживаемость клеток в зоне повреждения (например, при инфаркте миокарда или ишемии конечностей).
• Органоидов — сфероиды дифференцируют в миниатюрные органы (печень, почки, кишечник) для моделирования заболеваний и тестирования препаратов.

Исследование межклеточных взаимодействий

Гетеротипические сфероиды позволяют изучать:

• Иммунный ответ — сфероиды из опухолевых клеток и иммунных клеток (например, Т-лимфоцитов) моделируют микроокружение опухоли.
• Ангиогенез — сфероиды из эндотелиальных клеток формируют капилляроподобные структуры.
• Симбиоз — сфероиды из бактерий и эукариотических клеток используются для изучения микробиома.

Примеры

• Сфероиды из клеток линии MCF-7 (рак молочной железы) — стандартная модель для тестирования антиэстрогенных препаратов.
• Сфероиды из гепатоцитов HepG2 — применяются для оценки гепатотоксичности лекарств.
• Сфероиды из мезенхимальных стволовых клеток — используются для регенерации костной и хрящевой ткани.
• Сфероиды из клеток линии A549 (рак лёгкого) — модель для изучения радиорезистентности.

Интересные факты

• Сфероиды способны к самоорганизации: при диссоциации и повторной агрегации клетки могут восстанавливать исходную структуру.
• В 2019 году группа учёных из Массачусетского технологического института (MIT) создала сфероиды из клеток человека, способные к синтезу инсулина в ответ на глюкозу, что открывает перспективы для лечения диабета.
• Сфероиды могут быть получены из клеток пациентов для персонализированного тестирования лекарств («органоиды на чипе»).
• В России исследования сфероидов активно ведутся в Институте цитологии РАН (Санкт-Петербург) и на базе Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова.

Критика и ограничения

Несмотря на преимущества, сфероиды имеют ряд недостатков:

• Отсутствие сосудистой сети — сфероиды не имеют кровеносных сосудов, что ограничивает их размер (максимум 1–2 мм) и моделирование ангиогенеза.
• Гетерогенность — сфероиды из одной клеточной линии могут различаться по размеру, форме и плотности, что затрудняет стандартизацию.
• Сложность анализа — трёхмерная структура требует специальных методов визуализации (конфокальная микроскопия, микротомография) и обработки данных.
• Ограниченная применимость для метастазирования — сфероиды не моделируют все этапы метастатического каскада, такие как интравазация и экстравазация.

Источники

• Sutherland R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science, 1988.
• Friedrich J., Seidel C., Ebner R., Kunz-Schughart L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols, 2009.
• Lin R. Z., Chang H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal, 2008.
• Foty R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments, 2011.
• Mehta G., Hsiao A. Y., Ingram M., Luker G. D., Takayama S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release, 2012.
• Лаборатория клеточной биологии ИНЦ РАН. Методы культивирования клеточных сфероидов. Методические рекомендации, 2020.