Полимеразная цепная реакция¶

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной биологии, позволяющий многократно (экспоненциально) увеличивать концентрацию определённого фрагмента ДНК в образце. Метод основан на естественном механизме репликации ДНК и представляет собой циклический процесс, в ходе которого происходит избирательное копирование заданного участка нуклеиновой кислоты. ПЦР применяется в диагностике инфекций, генетических исследованиях, криминалистике, селекции и других областях.

¶История

Метод предложил американский биохимик Кэри Муллис в 1983 году, работая в компании Cetus. До этого увеличение числа копий ДНК требовало трудоёмкого клонирования в живых клетках. Идея циклического копирования с использованием двух праймеров и термостабильного фермента позволила автоматизировать процесс. В 1993 году Муллис получил за изобретение Нобелевскую премию по химии.

Ключевым шагом стало применение термостабильной ДНК-полимеразы. Первоначально использовалась полимераза из бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимераза), выделенная в 1976 году. Этот фермент выдерживает высокие температуры, необходимые для разделения цепей ДНК, что сделало возможным многократное повторение циклов без добавления нового фермента.

¶Принцип метода

Реакция протекает в термоциклере — приборе, который автоматически меняет температуру реакционной смеси по заданной программе. Каждый цикл включает три стадии:

Денатурация (обычно 94–96 °C) — двухцепочечная ДНК разделяется на отдельные цепи.
Отжиг праймеров (50–65 °C) — короткие синтетические олигонуклеотиды (праймеры) связываются с комплементарными участками матрицы.
Элонгация (72 °C) — ДНК-полимераза достраивает новые цепи, начиная от праймеров.

В реакционную смесь входят: матричная ДНК, два праймера, дезоксирибонуклеотиды (dNTP), ионы магния, буфер и термостабильная полимераза. Число копий целевого фрагмента удваивается в каждом цикле, поэтому за 30–40 циклов количество ДНК возрастает в миллиарды раз.

¶Виды ПЦР

Классическая (конечная) ПЦР — результат оценивают по окончании реакции методом гель-электрофореза.
ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) — сначала РНК переводится в ДНК с помощью обратной транскриптазы; применяется для выявления РНК-содержащих вирусов.
ПЦР в реальном времени (qPCR) — количество продукта измеряется непосредственно в ходе реакции по флуоресценции; позволяет количественно оценивать исходную концентрацию ДНК.
Цифровая ПЦР — реакция проводится в тысячах микрореакторов, что даёт абсолютный подсчёт молекул.
Мультиплексная ПЦР — одновременная амплификация нескольких мишеней в одной пробирке.

¶Применение

¶Медицинская диагностика

ПЦР — основной метод выявления возбудителей инфекций, включая вирусные гепатиты, туберкулёз, ВИЧ, а также коронавирусную инфекцию. Метод позволяет обнаружить патоген на ранних стадиях, когда другие способы малоинформативны. В России ПЦР-диагностика широко применяется в лабораториях Роспотребнадзора и клинических центрах.

¶Генетика и наследственные заболевания

Метод используется для выявления мутаций, определения носительства наследственных болезней, пренатальной диагностики и HLA-типирования при трансплантации.

¶Криминалистика

В судебной медицине ПЦР применяют для идентификации личности по биологическим следам — крови, слюне, волосам. Метод лежит в основе ДНК-дактилоскопии.

¶Наука и биотехнология

ПЦР применяется для секвенирования, клонирования генов, создания генетически модифицированных организмов, в филогенетике и палеогенетике.

¶Ограничения и особенности

Метод чрезвычайно чувствителен, поэтому загрязнение образца (контаминация) может дать ложноположительный результат. Для контроля используют отрицательные пробы. Кроме того, ПЦР выявляет наличие нуклеиновой кислоты, но не всегда свидетельствует о жизнеспособности возбудителя. Подбор праймеров требует знания нуклеотидной последовательности мишени, что ограничивает применение метода для неизвестных организмов.

¶Значение

Полимеразная цепная реакция стала одним из важнейших инструментов молекулярной биологии и медицины XX–XXI веков. Она ускорила диагностику инфекций, сделала возможным массовое тестирование, лежит в основе множества научных и прикладных методик. В России ПЦР-лаборатории действуют в системе здравоохранения, ветеринарного надзора и научных институтов.

¶Источники

Нобелевские лекции по химии, 1993
Учебники по молекулярной биологии (Альбертс и др.)
Методические материалы по лабораторной диагностике
Публикации Роспотребнадзора о ПЦР-диагностике