Секвенирование нуклеиновых кислот¶
Секвенирование — совокупность методов определения первичной последовательности (порядка) нуклеотидов в молекулах нуклеиновых кислот — ДНК и РНК. Термин происходит от английского sequencing — «упорядочивание». Секвенирование позволяет установить, в каком порядке в цепи располагаются четыре типа нуклеотидов: аденин (A), тимин (T), гуанин (G) и цитозин (C) в ДНК, а также урацил (U) вместо тимина в РНК. Метод является базовым инструментом молекулярной биологии, генетики, медицины и биоинформатики, лежит в основе проектов по расшифровке геномов и современных технологий персонализированной медицины.
¶История
Первые методы определения последовательности нуклеотидов появились в 1970-х годах. В 1977 году британский биохимик Фредерик Сэнгер разработал метод, основанный на терминации синтеза цепи дидезоксинуклеотидами, а американский исследователь Уолтер Гилберт предложил химический метод расщепления. За эти работы Сэнгер и Гилберт совместно с Полом Бергом получили Нобелевскую премию по химии в 1980 году. Метод Сэнгера, известный также как метод «обрыва цепи», на десятилетия стал основным и оставался стандартом точности.
В 1990 году стартовал международный проект «Геном человека», завершённый в основных чертах к 2003 году. В нём участвовали научные коллективы США, Великобритании, Японии, Франции, Германии и Китая. Секвенирование первого человеческого генома заняло около 13 лет и стоило порядка 3 млрд долларов. В России аналогичные работы велись в институтах Российской академии наук, в частности в Институте молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта и Институте биоорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова.
С середины 2000-х годов развиваются методы «следующего поколения» (NGS), резко снизившие стоимость и время анализа. К 2020-м годам секвенирование одного человеческого генома подешевело до нескольких сотен долларов.
¶Принципы и классификация
Все методы секвенирования основаны на чтении нуклеотидной последовательности либо путём синтеза комплементарной цепи, либо путём её физического прочтения. Выделяют несколько поколений технологий.
| Поколение | Примеры методов | Особенности |
|---|---|---|
| Первое | Метод Сэнгера, химический метод Максама — Гилберта | Высокая точность, низкая производительность |
| Второе | Платформы Illumina, Ion Torrent | Массовое параллельное чтение коротких фрагментов |
| Третье | Нано-поровое секвенирование (Oxford Nanopore), PacBio | Чтение длинных фрагментов в реальном времени |
Метод Сэнгера основан на включении в синтезируемую цепь дидезоксинуклеотидов, которые останавливают реакцию. Полученные фрагменты разной длины разделяют электрофорезом и определяют последовательность. Методы второго поколения проводят миллионы реакций одновременно, что обеспечивает высокую пропускную способность. Третье поколение позволяет читать фрагменты длиной в десятки тысяч нуклеотидов без предварительного копирования.
¶Применение
Секвенирование применяется в самых разных областях:
- Медицина. Диагностика наследственных заболеваний, выявление мутаций, определение онкогенных вариантов, подбор терапии при онкологических заболеваниях.
- Микробиология и вирусология. Идентификация возбудителей инфекций, в том числе при эпидемиях; отслеживание мутаций вирусов.
- Сельское хозяйство. Селекция растений и животных, анализ геномов сельскохозяйственных культур.
- Криминалистика. ДНК-идентификация личности.
- Фундаментальная наука. Изучение эволюции, филогении, регуляции генов, эпигенетики.
- Биотехнология. Создание штаммов микроорганизмов, синтетическая биология.
В России секвенирование используется в системах генетической диагностики, в работе центров по борьбе с инфекциями, а также в программах по изучению геномов народов страны.
¶Значение и перспективы
Секвенирование стало одним из ключевых методов биологии XXI века. Оно обеспечило переход к персонализированной медицине, позволило расшифровать геномы тысяч организмов и создать базы генетических данных. Развитие технологий направлено на снижение стоимости, увеличение точности и портативности приборов. Перспективными направлениями считаются одноклеточное секвенирование, анализ метагеномов окружающей среды и интеграция данных секвенирования с методами искусственного интеллекта для интерпретации результатов.
¶Источники
- Сэнгер Ф. Определение последовательности нуклеотидов в ДНК.
- Международный проект «Геном человека».
- Обзорные публикации по технологиям NGS.
- Материалы Института молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта.