SELEX

SELEX (от англ. Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment — систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением) — это лабораторный метод молекулярной биологии, предназначенный для отбора и амплификации специфических олигонуклеотидов (ДНК или РНК), способных связываться с заданной молекулой-мишенью с высокой аффинностью и специфичностью. В результате SELEX получают искусственные короткие нуклеиновые кислоты — аптамеры, которые по своим свойствам напоминают антитела, но обладают рядом преимуществ, включая химическую стабильность, простоту синтеза и возможность модификации.

История

Метод SELEX был впервые описан в 1990 году независимо двумя группами исследователей: лабораторией Ларри Голда (Университет Колорадо, Боулдер) и лабораторией Джойс Шостак (Массачусетская больница общего профиля, Гарвард). В 1990 году Голд и его коллеги опубликовали статью, в которой ввели термин SELEX, а Шостак с соавторами описали аналогичный процесс под названием «in vitro selection» (отбор in vitro). Оба подхода основывались на идее, что в большой случайной библиотеке олигонуклеотидов можно найти последовательности, способные связываться с определённой мишенью, и затем многократно отбирать и амплифицировать их.

Первоначально SELEX применялся для изучения взаимодействий нуклеиновых кислот с белками, но вскоре область его применения расширилась. В 1992 году были получены первые аптамеры к малым молекулам, а в 1994 году — к целым клеткам. В 2000-х годах метод был автоматизирован, что позволило проводить высокопроизводительный отбор с использованием роботизированных систем и микрочипов. В 2010-х годах появились модификации SELEX, такие как Cell-SELEX (отбор на живых клетках) и Capillary Electrophoresis SELEX (CE-SELEX), ускоряющие процесс.

Принцип метода

SELEX основан на циклическом повторении трёх основных этапов: инкубация, разделение и амплификация. Процесс начинается с создания библиотеки случайных олигонуклеотидов, обычно длиной 20–80 нуклеотидов, фланкированных консервативными последовательностями для праймеров. Размер библиотеки может достигать 10¹⁴–10¹⁵ уникальных молекул.

1. Инкубация: Библиотеку олигонуклеотидов смешивают с мишенью (белок, малая молекула, клетка, вирус и т. д.) в условиях, способствующих связыванию. Связавшиеся молекулы отделяют от несвязавшихся.
2. Разделение: Комплексы «мишень-олигонуклеотид» выделяют, например, с помощью аффинной хроматографии, фильтрации через мембрану (для белков), магнитных частиц или центрифугирования. Несвязанные молекулы удаляют.
3. Амплификация: Связанные олигонуклеотиды элюируют с мишени и амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) для ДНК или обратной транскрипции с последующей ПЦР (RT-PCR) для РНК. Полученную обогащённую библиотеку используют для следующего раунда.

Цикл повторяют 6–15 раз, пока не будет получена популяция аптамеров с максимальной аффинностью к мишени. На заключительном этапе аптамеры клонируют и секвенируют для определения их нуклеотидной последовательности.

Классификация и виды SELEX

SELEX классифицируют по типу мишени, способу разделения и формату проведения.

По типу мишени

• Белковый SELEX: Мишенью служит очищенный белок. Наиболее распространённый вариант.
• Маломолекулярный SELEX: Для малых молекул (например, токсины, лекарства, метаболиты) — сложнее из-за отсутствия эпитопов, но возможен с использованием иммобилизации.
• Cell-SELEX: Отбор на живых клетках, что позволяет получать аптамеры к мембранным белкам в нативном состоянии.
• Tissue-SELEX: Отбор на тканях или срезах органов.
• Virus-SELEX: Для вирусных частиц.

По способу разделения

• Affinity chromatography SELEX: Использует колонки с иммобилизованной мишенью.
• Membrane filtration SELEX: Разделение через нитроцеллюлозные мембраны, удерживающие белки.
• Magnetic bead SELEX: Мишень иммобилизуют на магнитных частицах.
• Capillary electrophoresis SELEX (CE-SELEX): Использует разницу в электрофоретической подвижности комплексов и свободных олигонуклеотидов. Ускоряет процесс до 1–4 раундов.
• Microfluidic SELEX: Микрофлюидные чипы для миниатюризации и автоматизации.

По формату

• Классический SELEX: Ручной или полуавтоматический.
• Автоматизированный SELEX: С использованием роботов (например, на платформе Biomek).
• High-throughput SELEX: Параллельный отбор множества мишеней с использованием микрочипов.

Применение

SELEX и полученные аптамеры находят применение в фундаментальных исследованиях, медицине, аналитике и биотехнологии.

Фундаментальные исследования

• Изучение взаимодействий нуклеиновых кислот с белками и другими молекулами.
• Идентификация новых регуляторных РНК (рибопереключателей, рибозимов).
• Исследование структуры и функции белков.

Медицина

• Диагностика: Аптамеры используются в биосенсорах (аптасенсорах) для выявления биомаркеров заболеваний, инфекций (например, ВИЧ, гепатит, туберкулёз) и рака. Пример: аптамер к тромбину используется в диагностике коагулопатий.
• Терапия: Аптамеры разрабатываются как лекарственные средства. Первый одобренный в 2004 году Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) аптамер — пэгаптаниб (Macugen) — применяется для лечения возрастной макулярной дегенерации. Другие аптамеры проходят клинические испытания для лечения рака, воспалительных заболеваний и тромбозов.
• Таргетная доставка: Аптамеры могут служить лигандами для нацеливания лекарств или наночастиц на определённые клетки (например, раковые).

Аналитическая химия и биосенсорика

• Создание аптасенсоров для обнаружения токсинов (например, микотоксины, ботулотоксин), пестицидов, наркотиков и взрывчатых веществ.
• Разработка тест-систем для быстрого анализа (например, для определения глюкозы или холестерина).

Биотехнология

• Аффинная очистка белков с использованием аптамерных колонок.
• Создание аптамерных массивов для протеомики.
• Регуляция экспрессии генов с помощью аптамеров (например, в синтетической биологии).

Преимущества и недостатки

Преимущества

• Химическая стабильность: Аптамеры устойчивы к денатурации и могут храниться при комнатной температуре.
• Простота синтеза: Химический синтез аптамеров дешевле и быстрее, чем производство антител.
• Низкая иммуногенность: Аптамеры редко вызывают иммунный ответ.
• Широкий диапазон мишеней: Возможность отбора к токсичным, неиммуногенным или малым молекулам.
• Модифицируемость: Аптамеры легко модифицировать (например, флуоресцентными метками, биотином, нуклеазами).

Недостатки

• Чувствительность к нуклеазам: Не модифицированные РНК-аптамеры быстро разрушаются в биологических жидкостях. Решается химическими модификациями (например, 2'-фтор- или 2'-O-метил-РНК).
• Ограниченная аффинность: Для некоторых мишеней (например, малых молекул) аффинность может быть ниже, чем у антител.
• Время отбора: Классический SELEX занимает от нескольких недель до месяцев, хотя современные методы (CE-SELEX) сокращают этот срок до 1–2 дней.
• Сложность для гидрофобных мишеней: Отбор аптамеров к липофильным молекулам затруднён.

Интересные факты

• В 2020 году метод SELEX был адаптирован для поиска аптамеров к белку шипа SARS-CoV-2, что позволило создать диагностические тесты на COVID-19.
• Аптамеры, полученные методом SELEX, иногда называют «химическими антителами» из-за их сходства с иммуноглобулинами.
• В России исследования по SELEX ведутся в ряде научных центров, включая Институт биоорганической химии РАН и Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова. Разрабатываются аптамеры для диагностики онкологических заболеваний (например, рака лёгкого и молочной железы) и инфекций (туберкулёз, ВИЧ).

Источники

• Gold L., Polisky B., Uhlenbeck O., et al. Diversity of oligonucleotide functions // Annual Review of Biochemistry. — 1995. — Vol. 64. — P. 763–797.
• Ellington A. D., Szostak J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands // Nature. — 1990. — Vol. 346. — P. 818–822.
• Tuerk C., Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase // Science. — 1990. — Vol. 249. — P. 505–510.
• Stoltenburg R., Reinemann C., Strehlitz B. SELEX—a (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands // Biomolecular Engineering. — 2007. — Vol. 24. — P. 381–403.
• Darmostuk M., Rimpelova S., Gbelcova H., et al. Current approaches in SELEX: An update to aptamer selection technology // Biotechnology Advances. — 2015. — Vol. 33. — P. 1141–1161.
• Mayer G. The chemical biology of aptamers // Angewandte Chemie International Edition. — 2009. — Vol. 48. — P. 2672–2689.