Аптамер¶

Аптамер — это короткая одноцепочечная молекула ДНК или РНК (реже — пептид), которая способна специфически связываться с определённой молекулой-мишенью за счёт своей трёхмерной структуры. Термин происходит от латинского aptus («подходящий») и греческого meros («часть»). Аптамеры рассматриваются как синтетический аналог антител, однако, в отличие от последних, получаются не биологическим путём, а химическим синтезом и селекцией in vitro.

¶История открытия

Аптамеры были независимо открыты в 1990 году двумя научными группами: лабораторией Ларри Голда (Университет Колорадо), которая назвала их «аптамерами» и разработала метод SELEX, и лабораторией Джойс Шек (Массачусетская больница общего профиля), которая использовала термин «лиганды РНК». Метод SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment — систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением) стал основным способом получения аптамеров. В 2001 году был открыт первый терапевтический аптамер — пегаптаниб (Macugen), одобренный FDA для лечения возрастной макулярной дегенерации.

¶Структура и свойства

Аптамеры представляют собой олигонуклеотиды длиной от 20 до 80 нуклеотидов. Их трёхмерная конформация формируется за счёт водородных связей, стэкинг-взаимодействий и электростатических сил. Благодаря этой структуре аптамер образует «карман» или «выступ», комплементарный участку молекулы-мишени.

Ключевые свойства:

Специфичность: аптамеры различают даже близкородственные молекулы, отличающиеся одной аминокислотой или функциональной группой.
Аффинность: константа диссоциации (Kd) обычно находится в диапазоне пико- и наномолярных концентраций, что сопоставимо с лучшими моноклональными антителами.
Термостабильность: ДНК-аптамеры выдерживают многократные циклы денатурации и ренатурации без потери активности.
Химическая стабильность: устойчивы к органическим растворителям и широкому диапазону pH; РНК-аптамеры менее стабильны из-за наличия 2'-гидроксильной группы.
Низкая иммуногенность: природные нуклеотиды редко вызывают иммунный ответ, что выгодно отличает аптамеры от антител.

¶Метод SELEX

Процесс получения аптамеров включает несколько этапов:

Создание случайной библиотеки олигонуклеотидов (обычно 10^13–10^15 вариантов).
Инкубация библиотеки с иммобилизованной мишенью.
Отмывка несвязавшихся молекул.
Элюция связавшихся последовательностей.
Амплификация отобранных молекул с помощью ПЦР (для ДНК) или ОТ-ПЦР (для РНК).
Повторение циклов (обычно 8–15 раундов) до достижения максимальной аффинности.
Клонирование и секвенирование обогащённой библиотеки.

Существуют модификации метода: Cell-SELEX (селекция на живых клетках), Capture-SELEX (для малых молекул), фотоаптамеры (с фотосшиваемыми нуклеотидами).

¶Применение

¶Медицина и диагностика

Аптамеры используются как:

Терапевтические агенты: пегаптаниб (ингибитор VEGF) применяется в офтальмологии; ряд аптамеров проходит клинические испытания для лечения онкологических, сердечно-сосудистых и инфекционных заболеваний.
Диагностические зонды: в биосенсорах (аптасенсорах) для выявления биомаркеров, патогенов, токсинов. Например, аптамеры к тромбину используются в лабораторных тестах.
Векторы доставки лекарств: аптамеры конъюгируют с наночастицами, липосомами или цитотоксическими препаратами для адресной доставки к опухолевым клеткам.

¶Аналитическая химия

Аптамеры применяются в аффинной хроматографии, капиллярном электрофорезе и масс-спектрометрии для выделения и концентрирования аналитов. Они служат альтернативой антителам в иммуноферментном анализе (ELISA), образуя формат ELASA (enzyme-linked aptamer sorbent assay).

¶Фундаментальные исследования

Аптамеры используются для изучения белок-белковых взаимодействий, визуализации внутриклеточных процессов, а также в качестве молекулярных переключателей (рибосвитчей) в синтетической биологии.

¶Преимущества и ограничения

К преимуществам аптамеров относят: воспроизводимость химического синтеза, низкую стоимость производства, возможность модификации (введение флуорофоров, биотина, PEG-групп), длительный срок хранения в лиофилизированном виде.

Ограничения включают: быструю деградацию нуклеазами в биологических жидкостях (решается введением 2'-фтор- или 2'-O-метил-модификаций, L-нуклеотидов — «спигельмеров»), быстрый почечный клиренс (компенсируется PEGилированием), а также потенциальную токсичность катионных липосом при доставке.

¶Перспективы

Ведутся работы по созданию пептидных аптамеров, аптамеров на основе L-РНК и XNA (ксенонуклеиновых кислот). Развиваются методы вычислительного дизайна аптамеров, не требующие экспериментальной селекции. В России исследования аптамеров ведутся в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск) и в ряде других научных центров.

¶Источники

Голд Л., Полисски Б., Ухленбек О., Ярус М. «Разнообразие олигонуклеотидных лигандов» // Annual Review of Biochemistry, 1995.
Шек Дж. В., Сасмор А. Д. «Систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением: лиганды РНК к бактериофагу T4 ДНК-полимеразе» // Science, 1990.
Нинтье С. М., Уайт Р. Р., Салливан Б. А. «Аптамеры: обзор» // Molecular Therapy — Nucleic Acids, 2017.
Кепплер К., Шерер К., Клоц К. «Аптамеры как инструменты для нанобиотехнологии» // Journal of Nanobiotechnology, 2020.