Аспартаттранскарбамоилаза

Аспартаттранскарбамоилаза (АТКаза, аспартаткарбамоилтрансфераза) — это фермент класса трансфераз (КФ 2.1.3.2), катализирующий первую реакцию в биосинтезе пиримидиновых нуклеотидов: перенос карбамоильной группы от карбамоилфосфата на аминогруппу L-аспартата с образованием N-карбамоил-L-аспартата (карбамоиласпартата). Этот фермент играет ключевую роль в регуляции синтеза пиримидинов и является классическим объектом изучения аллостерической регуляции и кинетики ферментативных реакций. АТКаза обнаружена у всех организмов, от бактерий до человека, и её структура и механизмы регуляции существенно различаются у прокариот и эукариот.

История открытия и изучения

Фермент аспартаттранскарбамоилаза был впервые идентифицирован и охарактеризован в 1950-х годах в ходе исследований метаболизма нуклеотидов. В 1956 году американские биохимики Артур Парди и Джон Герхарт (John Gerhart) выделили АТКазу из бактерии Escherichia coli (кишечная палочка) и показали, что её активность ингибируется конечным продуктом пиримидинового пути — цитидинтрифосфатом (ЦТФ). В 1960-х годах Парди и Герхарт совместно с Говардом Шахманом (Howard Schachman) детально изучили аллостерические свойства фермента, что стало одним из первых экспериментальных подтверждений модели аллостерической регуляции, предложенной Жаком Моно, Жаном-Пьером Шанжё и Франсуа Жакобом. В 1970-х годах была определена трёхмерная структура АТКазы E. coli с помощью рентгеновской кристаллографии, что позволило визуализировать её четвертичную структуру и механизм аллостерического перехода.

Структура

Прокариотическая АТКаза (на примере E. coli)

АТКаза E. coli представляет собой додекамер, состоящий из 12 субъединиц, организованных в два типа: каталитические (С-цепи) и регуляторные (R-цепи). Каталитическая субъединица (молекулярная масса около 34 кДа) содержит активный центр, где происходит связывание субстратов — аспартата и карбамоилфосфата. Регуляторная субъединица (около 17 кДа) связывает эффекторы: активатор АТФ и ингибитор ЦТФ. В целом фермент имеет форму (C₃R₃)₂, то есть два тримера каталитических субъединиц, соединённых с тремя димерами регуляторных субъединиц. Каждый регуляторный димер соединяет две каталитические субъединицы из разных тримеров.

Фермент существует в двух конформационных состояниях: активном (R-состояние, relaxed) и неактивном (T-состояние, tense). В T-состоянии каталитические субъединицы находятся в «закрытой» конформации, что затрудняет связывание субстратов. Связывание АТФ стабилизирует R-состояние, увеличивая сродство фермента к аспартату, тогда как ЦТФ стабилизирует T-состояние, снижая активность. Аллостерический переход между этими состояниями описывается моделью Моно—Уаймена—Шанжё (MWC-модель).

Эукариотическая АТКаза

У эукариот (дрожжи, растения, животные, включая человека) АТКаза является частью мультиферментного комплекса, называемого CAD (по первым буквам трёх ферментов: карбамоилфосфатсинтетаза II, аспартаттранскарбамоилаза, дигидрооротаза). Этот комплекс представляет собой один полипептид (молекулярная масса около 240 кДа), который содержит три каталитических домена, соответствующие трём ферментам начального этапа синтеза пиримидинов. У млекопитающих АТКаза не имеет отдельной регуляторной субъединицы; её аллостерическая регуляция осуществляется через домен карбамоилфосфатсинтетазы II, который ингибируется уридинтрифосфатом (УТФ) и активируется фосфорибозилпирофосфатом (ФРПФ). Структура эукариотической АТКазы менее изучена, чем прокариотической, но известно, что её активный центр гомологичен каталитическому центру бактериального фермента.

Каталитический механизм

Реакция, катализируемая АТКазой, протекает в две стадии:

1. Перенос карбамоильной группы: Карбамоилфосфат связывается в активном центре, и его карбамоильная группа (NH₂-CO-) переносится на аминогруппу L-аспартата, при этом отщепляется неорганический фосфат (Pi).
2. Образование N-карбамоил-L-аспартата: Продукт реакции — карбамоиласпартат — является непосредственным предшественником в синтезе дигидрооротата, который затем превращается в оротат, а далее — в уридинмонофосфат (УМФ) и другие пиримидиновые нуклеотиды.

Реакция является необратимой в физиологических условиях и требует присутствия ионов магния (Mg²⁺) в качестве кофактора. Оптимум pH для АТКазы E. coli составляет около 7,0–8,5.

Регуляция

Аллостерическая регуляция у прокариот

АТКаза E. coli является классическим примером аллостерического фермента, контролируемого по принципу обратной связи. Конечный продукт пиримидинового пути — ЦТФ — связывается с регуляторными субъединицами и ингибирует фермент, снижая его сродство к аспартату. Напротив, пуриновый нуклеотид АТФ является аллостерическим активатором: он увеличивает сродство фермента к аспартату, стимулируя синтез пиримидинов, когда клетка нуждается в обоих типах нуклеотидов. Такая регуляция обеспечивает баланс между пулами пуринов и пиримидинов.

Регуляция у эукариот

У эукариот регуляция АТКазы осуществляется в составе комплекса CAD. Основным ингибитором является УТФ (уридинтрифосфат), который связывается с доменом карбамоилфосфатсинтетазы II. Активатором служит ФРПФ — метаболит, указывающий на высокую потребность в нуклеотидах. Кроме того, активность CAD регулируется на уровне транскрипции и посттрансляционных модификаций (фосфорилирование), что позволяет клетке адаптировать синтез пиримидинов к фазе клеточного цикла и условиям роста.

Физиологическая роль

Аспартаттранскарбамоилаза является ключевым ферментом биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов (урацил, цитозин, тимин), которые входят в состав РНК и ДНК, а также участвуют в синтезе коферментов, липидов и гликозилировании белков. У бактерий АТКаза обеспечивает синтез нуклеотидов для роста и деления клеток. У эукариот, особенно в быстро делящихся клетках (например, в эмбриональных тканях и опухолях), активность CAD и АТКазы повышена, что делает этот фермент потенциальной мишенью для противоопухолевых препаратов.

Медицинское значение

Нарушения активности АТКазы связаны с рядом заболеваний. У человека мутации в гене CAD, кодирующем комплекс CAD, могут приводить к наследственным нарушениям синтеза пиримидинов, которые проявляются задержкой развития, неврологическими симптомами и иммунодефицитом. Ингибиторы АТКазы, такие как аналоги аспартата или карбамоилфосфата, исследуются как потенциальные противораковые средства, поскольку быстро делящиеся опухолевые клетки зависят от активного синтеза пиримидинов. Например, препарат N-фосфонацетил-L-аспартат (PALA) является конкурентным ингибитором АТКазы и проходил клинические испытания, но показал ограниченную эффективность из-за токсичности и компенсаторных механизмов клеток.

Сравнение с другими организмами

У разных групп организмов АТКаза имеет различную структуру и регуляцию:

• Бактерии: Додекамерная структура с отдельными каталитическими и регуляторными субъединицами. Регуляция ЦТФ и АТФ.
• Археи: У некоторых архей АТКаза является мономерным или димерным ферментом, нечувствительным к нуклеотидам.
• Дрожжи: Входят в состав комплекса, аналогичного CAD, но с некоторыми отличиями в регуляции.
• Растения: АТКаза также входит в мультиферментный комплекс, и её активность регулируется светом и уровнем АТФ/УТФ.
• Человек: В составе CAD, с регуляцией УТФ и ФРПФ.

Методы исследования

Для изучения АТКазы применяются:

• Кинетические методы: Измерение скорости реакции при различных концентрациях субстратов и эффекторов (например, построение кривых Михаэлиса—Ментен и анализ кооперативности).
• Рентгеновская кристаллография: Определение трёхмерной структуры фермента в различных конформациях.
• Мутагенез: Замена аминокислот в активном центре или регуляторных доменах для выяснения их роли.
• Спектроскопия: Использование флуоресцентных меток для отслеживания конформационных изменений.

Интересные факты

• АТКаза E. coli стала одним из первых ферментов, для которого была экспериментально подтверждена модель аллостерической регуляции, что привело к созданию MWC-модели.
• Фермент обладает положительной кооперативностью по отношению к аспартату: связывание одной молекулы аспартата облегчает связывание следующих, что проявляется в сигмоидной кинетике.
• В 1970-х годах была получена кристаллическая структура АТКазы с разрешением 2,8 Å, что позволило детально описать её четвертичную структуру.

Источники

• Gerhart J. C., Pardee A. B. The enzymology of control by feedback inhibition // Journal of Biological Chemistry. — 1962. — Vol. 237. — P. 891–896.
• Schachman H. K. Aspartate transcarbamoylase: a classic example of allosteric regulation // Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology. — 1974. — Vol. 41. — P. 1–36.
• Lipscomb W. N., Kantrowitz E. R. Structure and function of aspartate transcarbamoylase // Accounts of Chemical Research. — 1982. — Vol. 15. — P. 281–288.
• Evans D. R. CAD: a multifunctional protein involved in the early steps of pyrimidine biosynthesis // Biochemical Journal. — 1986. — Vol. 240. — P. 1–12.
• Nelson D. L., Cox M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. — 7th ed. — W. H. Freeman, 2017. — Chapter 15: Principles of Metabolic Regulation.