Открыть сервисСервис
Главная → Блог → Bisulfite sequencing

Bisulfite sequencing

Бисульфитное секвенирование (англ. bisulfite sequencing, BS-seq) — это лабораторный метод, основанный на химической обработке ДНК бисульфитом натрия с последующим секвенированием, позволяющий определять статус метилирования цитозиновых оснований в геноме. Метод считается «золотым стандартом» для анализа метилирования ДНК на уровне отдельных нуклеотидов, так как обеспечивает разрешение в один нуклеотид и количественную оценку доли метилированных копий в образце.

Принцип метода

В основе бисульфитного секвенирования лежит химическая реакция, при которой бисульфит натрия избирательно дезаминирует неметилированные цитозины, превращая их в урацил. Метилированные цитозины (5-метилцитозин, 5mC) и гидроксиметилированные цитозины (5hmC) устойчивы к этому воздействию и остаются неизменными. После обработки бисульфитом ДНК амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или секвенируют напрямую. В процессе ПЦР урацил реплицируется как тимин, что приводит к замене неметилированных цитозинов на тимин в последовательности прочтения. Сравнивая полученную последовательность с эталонным геномом, можно определить, какие цитозины были метилированы: если в прочтении на месте цитозина стоит тимин — цитозин был неметилирован; если цитозин — метилирован.

История

Метод был впервые описан в 1992 году группой Марианны Фроммер и Стивена Бейлина (США) как способ анализа метилирования отдельных генов с помощью секвенирования по Сэнгеру. В 2000-х годах, с развитием технологий высокопроизводительного секвенирования (NGS), бисульфитное секвенирование было адаптировано для анализа всего генома (whole-genome bisulfite sequencing, WGBS) и репрезентативных участков (reduced representation bisulfite sequencing, RRBS). В 2009 году был опубликован первый полный метилом человека, полученный методом WGBS. С тех пор метод остаётся основным инструментом в эпигенетике, несмотря на появление альтернативных подходов (например, нанопоровое секвенирование).

Виды бисульфитного секвенирования

По охвату генома

  • Полногеномное бисульфитное секвенирование (WGBS) — секвенирование всей ДНК образца после бисульфитной обработки. Позволяет получить карту метилирования всего генома с разрешением в один нуклеотид, но требует высокой стоимости и глубины секвенирования (обычно 30× и более).
  • Репрезентативное бисульфитное секвенирование (RRBS) — основано на расщеплении ДНК рестриктазой MspI (распознаёт сайт CCGG), которая обогащает фрагменты, богатые CpG-динуклеотидами. После бисульфитной обработки секвенируют только эти фрагменты. Метод экономичен, но охватывает лишь около 5–10% CpG-сайтов генома, преимущественно в промоторах и CpG-островках.
  • Целевое бисульфитное секвенирование (targeted BS-seq) — включает амплификацию конкретных участков (например, промоторов генов) с помощью ПЦР с последующим секвенированием. Используется для валидации результатов или анализа небольших регионов.

По типу секвенирования

  • Секвенирование по Сэнгеру — классический метод для анализа единичных клонов или ампликонов. Даёт точные данные, но малопроизводителен.
  • Высокопроизводительное секвенирование (NGS) — позволяет одновременно анализировать миллионы фрагментов. Используется в WGBS, RRBS и таргетных подходах.
  • Одномолекулярное секвенирование (например, нанопоровое секвенирование Oxford Nanopore) — может определять метилирование напрямую, без бисульфитной обработки, но бисульфитный вариант также применяется для повышения точности.

Протокол

Типичный протокол бисульфитного секвенирования включает следующие этапы:

  1. Выделение ДНК из образца (ткани, клетки, биологические жидкости).
  2. Фрагментация ДНК (для WGBS и RRBS) — обычно ультразвуком или ферментативно.
  3. Бисульфитная обработка — инкубация ДНК с бисульфитом натрия при повышенной температуре (обычно 70–90 °C) в течение нескольких часов. В результате неметилированные цитозины превращаются в урацил.
  4. Очистка обработанной ДНК от бисульфита и солей (например, с помощью колонок или магнитных частиц).
  5. Подготовка библиотеки для секвенирования: лигирование адаптеров, амплификация (ПЦР). Важно использовать ДНК-полимеразу, устойчивую к урацилу (например, PfuTurbo Cx).
  6. Секвенирование на платформе NGS (Illumina, MGI, Ion Torrent) или по Сэнгеру.
  7. Биоинформатический анализ — выравнивание прочтений на эталонный геном (с учётом C→T-конверсии), вызов метилирования (доля метилированных цитозинов в каждом сайте), статистическая обработка.

Биоинформатический анализ

Обработка данных бисульфитного секвенирования требует специализированных инструментов, так как выравнивание прочтений с C→T-конверсией (неметилированные цитозины заменены на тимин) отличается от стандартного. Основные этапы:

  • Контроль качества — удаление адаптеров, низкокачественных прочтений (FastQC, Trimmomatic).
  • Выравнивание — с помощью выравнивателей, учитывающих бисульфитную конверсию: Bismark, BWA-meth, BS-Seeker2, BatMeth. Они преобразуют обе цепи (C→T и G→A) и сравнивают с эталоном.
  • Вызов метилирования — для каждого CpG-сайта (или другого контекста, например CHG, CHH) рассчитывается отношение числа прочтений с C к общему числу прочтений. Инструменты: MethylDackel, Bismark methylation extractor, Bsseq.
  • Дифференциальное метилирование — сравнение образцов (например, здоровые vs больные ткани) с помощью статистических пакетов (DSS, methylKit, bsseq).
  • Визуализация — метиломные карты, тепловые карты, профили метилирования в геномных браузерах (IGV, UCSC).

Применение

Бисульфитное секвенирование широко используется в фундаментальных и прикладных исследованиях:

  • Изучение эпигенетики развития — анализ метилирования в эмбриогенезе, дифференцировке стволовых клеток, репрограммировании.
  • Онкология — выявление аберрантного метилирования промоторов генов-супрессоров опухолей (например, BRCA1, MLH1) и диагностика рака на основе метиломных маркеров.
  • Нейробиология — роль метилирования в пластичности нейронов, памяти, нейродегенеративных заболеваниях (болезнь Альцгеймера, шизофрения).
  • Сельское хозяйство — эпигенетическая регуляция стрессоустойчивости растений, качества плодов, адаптации к климату.
  • Клиническая диагностика — анализ метилирования ДНК в жидкой биопсии (например, для раннего выявления рака лёгкого, колоректального рака).
  • Фармакогеномика — изучение влияния метилирования на экспрессию генов, ответственных за метаболизм лекарств.

Ограничения и недостатки

  • Деградация ДНК — бисульфитная обработка вызывает гидролиз и фрагментацию ДНК, что снижает выход и качество библиотек, особенно для длинных фрагментов.
  • Потеря информации о метилировании в не-CpG контекстах — стандартный протокол не различает 5mC и 5hmC, что может быть критично для тканей с высоким уровнем гидроксиметилирования (например, мозг).
  • Сложность выравнивания — C→T-конверсия снижает сложность генома, увеличивая число многозначных выравниваний, особенно в повторяющихся регионах.
  • Высокая стоимость — полногеномное секвенирование (WGBS) требует значительных затрат на секвенирование (30–60 млн прочтений на образец для человека).
  • Артефакты — неполная конверсия (ложно-положительное метилирование) или переконверсия (ложно-отрицательное) могут искажать результаты. Требуется контроль с помощью неметилированной ДНК (например, фага лямбда).

Альтернативные методы

  • Анализ метилирования с помощью ферментов — например, метод EM-seq (Enzymatic Methyl-seq) использует ферменты (TET2, APOBEC) вместо бисульфита, что снижает деградацию ДНК.
  • Нанопоровое секвенирование (Oxford Nanopore) — прямое определение метилирования по изменению ионного тока, без химической обработки.
  • Метилирование-специфическая ПЦР (MSP) — качественный анализ метилирования конкретных сайтов, менее точный, но быстрый и дешёвый.
  • Иммунопреципитация метилированной ДНК (MeDIP-seq) — обогащение метилированных фрагментов антителами, даёт низкое разрешение (100–300 п.н.).

Интересные факты

  • Бисульфитное секвенирование позволило обнаружить, что метилирование ДНК у млекопитающих происходит преимущественно в CpG-контексте (около 70–80% CpG-сайтов метилированы), тогда как у растений — также в CHG и CHH (где H — A, C или T).
  • В 2015 году метод WGBS был использован для создания первого полного метилома человека (проект ENCODE), что выявило около 28 миллионов CpG-сайтов.
  • Бисульфитная обработка может быть выполнена не только на ДНК, но и на РНК (бисульфитное секвенирование РНК) для анализа метилирования аденозина (m6A) и других модификаций.

Источники

  • Frommer M., McDonald L.E., Millar D.S. et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1992, 89(5): 1827–1831.
  • Ziller M.J., Gu H., Müller F. et al. Charting a dynamic DNA methylation landscape of the human genome. Nature, 2013, 500(7463): 477–481.
  • Lister R., Pelizzola M., Dowen R.H. et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature, 2009, 462(7271): 315–322.
  • Krueger F., Andrews S.R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics, 2011, 27(11): 1571–1572.
  • Suzuki M.M., Bird A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature Reviews Genetics, 2008, 9(6): 465–476.

Похожие материалы

Заметили ошибку или не согласны с информацией в статье? Напишите нам support@bfometr.ru