Высокопроизводительное секвенирование

Высокопроизводительное секвенирование (также известное как секвенирование нового поколения, NGS, от англ. Next-Generation Sequencing) — это совокупность методов и технологий определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК, которые позволяют одновременно анализировать миллионы и миллиарды фрагментов генетического материала в одном эксперименте. В отличие от классического метода Сэнгера, который секвенирует один фрагмент за раз, высокопроизводительное секвенирование обеспечивает массовый параллелизм, что радикально увеличивает скорость и снижает стоимость анализа геномов, транскриптомов и эпигеномов.

История развития

Предпосылки и появление (1990-е — 2005)

До середины 2000-х годов основным методом секвенирования оставался метод Сэнгера (дидезоксинуклеотидное секвенирование), разработанный в 1977 году. Его производительность была ограничена: для секвенирования одного человеческого генома в рамках проекта «Геном человека» (1990–2003) потребовалось более 10 лет и около 3 миллиардов долларов США. Осознание необходимости удешевления и ускорения процесса привело к разработке новых подходов. В 2005 году компания 454 Life Sciences (США) представила первую коммерческую платформу NGS — Genome Sequencer 20, основанную на пиросеквенировании в эмульсионной ПЦР. Это событие считается началом эры высокопроизводительного секвенирования.

Эра быстрого развития (2005–2015)

Вслед за 454 Life Sciences на рынок вышли другие технологии. В 2006 году компания Solexa (позже поглощённая Illumina) представила технологию секвенирования с использованием обратимых терминаторов и мостиковой амплификации. К 2010 году платформы Illumina стали доминирующими благодаря высокой точности и относительно низкой стоимости за нуклеотид. В 2007 году компания Applied Biosystems (США) запустила систему SOLiD, основанную на лигировании олигонуклеотидов. Параллельно развивались методы секвенирования единичных молекул в реальном времени (SMRT, Pacific Biosciences, 2011) и нанопоровое секвенирование (Oxford Nanopore Technologies, 2014). Эти технологии позволили получать сверхдлинные прочтения (десятки тысяч нуклеотидов), что критически важно для сборки сложных геномов.

Современный этап (2015 — настоящее время)

С 2015 года основное развитие сосредоточено на увеличении пропускной способности, снижении стоимости и повышении доступности. Платформы Illumina (NovaSeq, HiSeq) обеспечивают секвенирование терабаз данных за один запуск. Технологии третьего поколения (Pacific Biosciences, Oxford Nanopore) совершенствуются в точности, достигая уровня, сопоставимого с короткими прочтениями. В России разработкой методов NGS занимаются в Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН и в компании «Синтол» (Москва). Стоимость секвенирования человеческого генома снизилась с 3 млрд долларов в 2003 году до менее 1000 долларов к 2020 году.

Принципы и технологии

Общая схема

Независимо от конкретной платформы, высокопроизводительное секвенирование включает несколько этапов:

Подготовка библиотеки — фрагментация ДНК или РНК, присоединение адаптеров (универсальных последовательностей для посадки на чип или в пору) и, при необходимости, амплификация.
Иммобилизация и амплификация — фиксация фрагментов на твёрдой подложке (чип, гранула) и их клональное размножение для усиления сигнала.
Секвенирование — циклическое считывание нуклеотидной последовательности с помощью различных химических или физических методов.
Биоинформатический анализ — обработка сырых данных (чтений), выравнивание на референсный геном, сборка de novo, поиск вариантов (SNP, инделы, структурные варианты).

Основные технологии

Секвенирование с обратимыми терминаторами (Illumina)

Наиболее распространённая технология. Фрагменты ДНК фиксируются на стеклянной поверхности (проточной ячейке) и амплифицируются методом мостиковой ПЦР, образуя кластеры из идентичных копий. Секвенирование происходит путём добавления меченых флуорофорами нуклеотидов с обратимыми терминаторами. После каждого цикла включения нуклеотида считывается флуоресцентный сигнал, терминатор удаляется, и цикл повторяется. Длина прочтений обычно составляет 150–300 нуклеотидов (парных концов). Точность — более 99,9%.

Пиросеквенирование (454 Life Sciences)

Основано на детекции пирофосфата, выделяющегося при включении нуклеотида. Фрагменты амплифицируются на гранулах в эмульсии. В ходе секвенирования нуклеотиды подаются последовательно; если нуклеотид включается, выделяется световой сигнал, регистрируемый камерой. Длина прочтений достигала 700 нуклеотидов, но технология вытеснена платформами Illumina из-за более высокой стоимости и ошибок в гомополимерных участках.

Секвенирование на основе лигирования (SOLiD)

Использует лигирование (сшивание) меченых олигонуклеотидов вместо полимеризации. Каждый цикл включает гибридизацию и лигирование короткого зонда, затем считывание флуоресцентного сигнала. Технология обеспечивает высокую точность (99,9%), но короткие прочтения (до 75 нуклеотидов) и сложный биоинформатический анализ ограничили её применение.

Секвенирование единичных молекул в реальном времени (SMRT, Pacific Biosciences)

Технология третьего поколения. Единичная молекула ДНК-полимеразы фиксируется на дне нанофотокамеры (ZMW). В ходе полимеризации флуоресцентно меченые нуклеотиды включаются в цепь, и их сигнал регистрируется в реальном времени. Длина прочтений достигает 30 000 нуклеотидов и более. Точность исходно была низкой (85–90%), но благодаря циклическому секвенированию (CCS) достигает 99,9%. Применяется для сборки геномов, обнаружения структурных вариантов и метилирования.

Нанопоровое секвенирование (Oxford Nanopore Technologies)

Молекула ДНК или РНК проходит через белковую нанопору, встроенную в мембрану. Изменение ионного тока через пору при прохождении каждого нуклеотида позволяет определить последовательность. Длина прочтений теоретически не ограничена (до 2 миллионов нуклеотидов). Точность исходно составляла 85–92%, но современные версии (R10.4) достигают 99% при использовании консенсусных методов. Портативные устройства (MinION) позволяют проводить секвенирование в полевых условиях.

Применение

Фундаментальные исследования

Геномика: секвенирование геномов организмов, сравнительная геномика, филогенетика.
Транскриптомика: анализ экспрессии генов (RNA-seq), выявление альтернативного сплайсинга, некодирующих РНК.
Эпигеномика: картирование метилирования ДНК (bisulfite-seq), модификаций гистонов (ChIP-seq), открытого хроматина (ATAC-seq).
Метагеномика: анализ микробных сообществ окружающей среды и организма человека (микробиом).

Медицина и здравоохранение

Диагностика наследственных заболеваний: секвенирование экзома (WES) или генома (WGS) для выявления мутаций.
Онкология: секвенирование опухолевой ДНК (жидкостная биопсия) для выявления соматических мутаций, мониторинга рецидивов.
Фармакогеномика: подбор лекарств на основе генетического профиля пациента.
Инфекционные болезни: идентификация патогенов, определение антибиотикорезистентности, эпидемиологический надзор (например, секвенирование SARS-CoV-2).

Сельское хозяйство и экология

Селекция растений и животных: маркер-ассоциированная селекция, геномное редактирование.
Экологический мониторинг: оценка биоразнообразия с помощью ДНК-баркодинга.

Судебная медицина и криминалистика

Идентификация личности: секвенирование коротких тандемных повторов (STR) и однонуклеотидных полиморфизмов (SNP).
Установление родства: анализ митохондриальной ДНК и Y-хромосомы.

Преимущества и ограничения

Преимущества

Высокая пропускная способность: возможность секвенировать целые геномы за несколько часов.
Низкая стоимость: стоимость одного нуклеотида в тысячи раз ниже, чем при методе Сэнгера.
Универсальность: применимость к ДНК, РНК, метилированной ДНК, белкам.
Автоматизация: большинство этапов автоматизированы, что снижает влияние человеческого фактора.

Ограничения

Ошибки секвенирования: особенно в гомополимерных участках (для нанопорового секвенирования) и при низком покрытии.
Сложность биоинформатического анализа: требует значительных вычислительных ресурсов и квалифицированных специалистов.
Длина прочтений: короткие прочтения (Illumina) затрудняют сборку повторяющихся участков генома.
Затраты на оборудование: стоимость приборов и расходных материалов остаётся высокой для небольших лабораторий.

Критика и этические аспекты

Развитие высокопроизводительного секвенирования вызывает дискуссии о конфиденциальности генетических данных, возможности дискриминации на основе генетической информации, а также о рисках неправильной интерпретации результатов (например, клинически незначимых вариантов). В России действует Федеральный закон «О геномной регистрации» (№ 242-ФЗ), регулирующий сбор и хранение генетических данных в криминалистических целях. В ряде стран (США, страны ЕС) приняты законы, запрещающие генетическую дискриминацию в сфере страхования и трудоустройства.

Перспективы

Основные направления развития включают:

Снижение стоимости до 100 долларов за геном.
Увеличение длины прочтений без потери точности.
Интеграция с технологиями редактирования генома (CRISPR) для функциональной валидации вариантов.
Развитие портативных устройств для полевой диагностики.
Создание референсных геномов для всех видов (проект Earth BioGenome).

Источники

Metzker, M. L. (2010). Sequencing technologies — the next generation. Nature Reviews Genetics, 11(1), 31–46.
Goodwin, S., McPherson, J. D., & McCombie, W. R. (2016). Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics, 17(6), 333–351.
Shendure, J., & Ji, H. (2008). Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology, 26(10), 1135–1145.
Федеральный закон «О геномной регистрации» от 03.12.2008 № 242-ФЗ (ред. от 17.02.2023).
Лекции по высокопроизводительному секвенированию, Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, 2022.

BFOmetr — база данных и аналитика по компаниям России.

На главную BFOmetr →