Открыть сервисСервис
Главная → Блог → Полногеномное бисульфитное секвенирование

Полногеномное бисульфитное секвенирование

Полногеномное бисульфитное секвенирование (WGBS, от англ. Whole-Genome Bisulfite Sequencing) — это высокопроизводительный метод молекулярной биологии, позволяющий определить статус метилирования цитозиновых оснований во всём геноме организма на уровне отдельных нуклеотидов. Метод основан на химической обработке ДНК бисульфитом натрия, который дезаминирует неметилированные цитозины, превращая их в урацил, в то время как 5-метилцитозины (5mC) остаются неизменными. Последующее секвенирование и сравнение полученных последовательностей с эталонным геномом позволяет картировать сайты метилирования с разрешением в один нуклеотид. WGBS считается «золотым стандартом» для изучения метилома — совокупности всех метилированных участков генома.

История

Метод бисульфитного секвенирования был впервые предложен в 1992 году Марианной Фроммер и её коллегами для анализа метилирования отдельных генов. Изначально он применялся в сочетании с капиллярным секвенированием по Сэнгеру, что было трудоёмко и ограничивало объём анализируемых участков. Развитие технологий высокопроизводительного секвенирования (NGS, от англ. Next-Generation Sequencing) в середине 2000-х годов позволило масштабировать метод на весь геном. Первое полногеномное бисульфитное секвенирование генома человека было выполнено в 2008 году в рамках проекта ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) на клеточной линии H1. С тех пор метод активно совершенствовался: снижалась стоимость секвенирования, разрабатывались протоколы для работы с малыми количествами ДНК и одноклеточного анализа, а также создавались алгоритмы биоинформатической обработки данных.

Принцип метода

Химическая реакция с бисульфитом

Основу метода составляет селективное дезаминирование цитозинов. При обработке ДНК бисульфитом натрия (NaHSO₃) в кислой среде (pH ~5) неметилированные цитозины (C) гидролизуются до урацила (U). Метилированные цитозины (5mC) и гидроксиметилированные цитозины (5hmC) устойчивы к этой реакции и остаются в виде цитозинов. Таким образом, после бисульфитной конверсии исходная информация о метилировании кодируется в виде замен C→T (после ПЦР-амплизации урацил заменяется на тимин) в прочтённых последовательностях.

Этапы выполнения

  1. Выделение и фрагментация ДНК: Геномную ДНК извлекают из образца (ткани, клетки, биологическая жидкость) и фрагментируют до размеров 200–500 пар оснований, обычно с помощью ультразвука или ферментативной обработки.
  2. Бисульфитная конверсия: Фрагментированную ДНК обрабатывают бисульфитом натрия. Для повышения эффективности конверсии добавляют денатурирующие агенты (например, формамид) и проводят реакцию при повышенной температуре (50–70 °C) в течение нескольких часов.
  3. Очистка и амплификация: После конверсии ДНК очищают от солей и проводят ПЦР-амплификацию с использованием специальных праймеров, не содержащих CpG-динуклеотиды, чтобы избежать дискриминации метилированных и неметилированных последовательностей. В ходе ПЦР урацил заменяется на тимин.
  4. Подготовка библиотеки: Амплифицированные фрагменты лигируют с адаптерами, необходимыми для секвенирования на платформах NGS (Illumina, MGI и др.). Библиотеки могут быть обогащены целевыми регионами (например, с помощью гибридизационного захвата) или использованы для полногеномного анализа.
  5. Секвенирование: Библиотеки секвенируют на платформах высокопроизводительного секвенирования, получая миллионы коротких прочтений (reads) длиной 100–150 пар оснований.
  6. Биоинформатический анализ: Полученные прочтения выравнивают на эталонный геном, учитывая, что после бисульфитной конверсии неметилированные C превратились в T. Для этого используют специализированные выравниватели (например, Bismark, BWA-meth, BSmooth). После выравнивания для каждого CpG-сайта рассчитывают степень метилирования как отношение числа прочтений, содержащих C, к общему числу прочтений, покрывающих данный сайт.

Классификация и варианты метода

По масштабу анализа

  • Полногеномное бисульфитное секвенирование (WGBS): Анализирует все CpG-сайты генома. Обеспечивает максимальное покрытие, но требует высокой глубины секвенирования (обычно 30–60 млн прочтений на геном человека) и значительных вычислительных ресурсов.
  • Редуцированное бисульфитное секвенирование (RRBS, от англ. Reduced Representation Bisulfite Sequencing): Использует фермент рестрикции MspI, который разрезает ДНК по сайтам CCGG, обогащая CpG-богатые регионы (промоторы, островки CpG). Позволяет снизить стоимость и объём секвенирования, но не покрывает все CpG-сайты.
  • Целевое бисульфитное секвенирование (Targeted BS-seq): Анализирует только определённые участки генома (например, панели генов, связанных с раком) с помощью гибридизационного захвата или мультиплексной ПЦР. Обеспечивает высокую глубину покрытия при низкой стоимости.

По типу анализируемых модификаций

  • Стандартное WGBS: Определяет 5-метилцитозин (5mC). Не различает 5mC и 5-гидроксиметилцитозин (5hmC), так как оба устойчивы к бисульфиту.
  • Окси-бисульфитное секвенирование (oxBS-seq): Включает дополнительный этап окисления 5hmC до 5-формилцитозина, который затем дезаминируется бисульфитом. Позволяет раздельно детектировать 5mC и 5hmC.
  • TAB-seq (Tet-Assisted Bisulfite Sequencing): Использует фермент TET для защиты 5hmC от дезаминирования, что позволяет напрямую картировать 5hmC.

Применение

Фундаментальные исследования

  • Эпигенетика развития: Изучение динамики метилирования в процессе эмбриогенеза, дифференцировки клеток и репрограммирования. WGBS используется для построения эпигенетических карт (например, в проекте Roadmap Epigenomics).
  • Исследование заболеваний: Выявление аберрантного метилирования при раке (например, гиперметилирование промоторов генов-супрессоров опухолей, гипометилирование повторяющихся элементов), нейродегенеративных и аутоиммунных заболеваниях.
  • Эволюционная биология: Сравнительный анализ метилома у разных видов для понимания эволюции эпигенетической регуляции.

Клиническая медицина

  • Диагностика рака: WGBS биопсийных образцов и циркулирующей опухолевой ДНК (ctDNA) в плазме крови позволяет выявлять эпигенетические маркеры для ранней диагностики, прогноза и мониторинга терапии.
  • Пренатальная диагностика: Анализ метилирования в крови матери для определения хромосомных аномалий плода (например, синдрома Дауна) и оценки срока беременности.
  • Фармакогеномика: Изучение влияния метилирования на экспрессию генов, участвующих в метаболизме лекарств, для персонализированной терапии.

Сельское хозяйство

  • Селекция растений: Идентификация эпигенетических вариантов, связанных с урожайностью, устойчивостью к стрессам и качеством продукции.
  • Животноводство: Анализ метилома для улучшения продуктивных качеств и здоровья сельскохозяйственных животных.

Ограничения и критика

  • Высокая стоимость: WGBS остаётся дорогим методом из-за необходимости глубокого секвенирования (до 30–60 млн прочтений на геном человека). Для сравнения, RRBS или целевые подходы значительно дешевле.
  • Требования к качеству ДНК: Бисульфитная обработка деградирует ДНК, что приводит к потере материала и фрагментации. Для анализа требуется исходное количество ДНК не менее 100 нг, хотя существуют протоколы для работы с 1–10 нг.
  • Сложность биоинформатического анализа: Выравнивание бисульфит-конвертированных прочтений требует специализированных алгоритмов и значительных вычислительных мощностей. Необходима коррекция на систематические ошибки (например, GC-состав, смещение покрытия).
  • Неспособность различать 5mC и 5hmC: Стандартное WGBS не отличает метилирование от гидроксиметилирования, что может искажать интерпретацию, особенно в тканях мозга, где 5hmC распространён.
  • Сложность интерпретации: Метилирование — динамичный процесс, зависящий от типа клеток, стадии развития и внешних факторов. Результаты WGBS отражают усреднённый профиль гетерогенной популяции клеток, что затрудняет идентификацию редких эпигенетических событий.

Интересные факты

  • Первый полногеномный метилом человека (клеточная линия H1) был опубликован в 2009 году в журнале Nature группой под руководством Джозефа Экера (Joseph Ecker) из Института Солка.
  • WGBS позволяет выявлять не только метилирование CpG-сайтов, но и метилирование в не-CpG контексте (CHG, CHH, где H — A, C или T), что характерно для растений и эмбриональных стволовых клеток млекопитающих.
  • В 2014 году был разработан метод одноклеточного WGBS (scWGBS), который позволяет изучать гетерогенность метилирования между отдельными клетками, что важно для понимания клеточной дифференцировки и рака.

Источники

  • Frommer M., et al. (1992). A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proceedings of the National Academy of Sciences, 89(5), 1827–1831.
  • Lister R., et al. (2009). Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature, 462(7271), 315–322.
  • Ziller M.J., et al. (2013). Charting a dynamic DNA methylation landscape of the human genome. Nature, 500(7463), 477–481.
  • Krueger F., Andrews S.R. (2011). Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics, 27(11), 1571–1572.
  • Booth M.J., et al. (2012). Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science, 336(6083), 934–937.
  • Roadmap Epigenomics Consortium (2015). Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature, 518(7539), 317–330.

Похожие материалы

Заметили ошибку или не согласны с информацией в статье? Напишите нам support@bfometr.ru