Биуретовая реакция: метод обнаружения белков¶

Биуретовая реакция — качественный колориметрический метод обнаружения белков, пептидов и других соединений, содержащих не менее двух пептидных связей, основанный на образовании окрашенного комплекса с ионами меди(II) в щелочной среде. Метод получил название в честь биурета — продукта термического разложения мочевины, который также даёт положительную реакцию. Биуретовая реакция является одним из старейших и наиболее универсальных способов идентификации белковых веществ в растворах.

¶Принцип метода

В основе реакции лежит способность пептидных связей (−CO−NH−) образовывать координационные соединения с ионами меди. В щелочной среде атомы азота пептидных групп депротонируются и связываются с ионом Cu²⁺, формируя стабильный хелатный комплекс фиолетового цвета. Для протекания реакции необходимо наличие в молекуле как минимум двух пептидных связей, расположенных определённым образом, что делает метод специфичным для дипептидов и более длинных полипептидов. Свободные аминокислоты и дипептиды реакции не дают.

Окрашенный комплекс имеет максимум поглощения света при длине волны около 540 нм, что позволяет использовать метод не только для качественного, но и для количественного определения белка с помощью спектрофотометрии. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации пептидных связей в растворе.

¶Методика проведения

Классическая процедура включает добавление к исследуемому раствору равного объёма 10%-го раствора гидроксида натрия (или калия) с последующим внесением нескольких капель 1%-го раствора сульфата меди(II). При положительном результате наблюдается появление фиолетового, сине-фиолетового или красно-фиолетового окрашивания. Окраска развивается в течение нескольких минут и сохраняется достаточно долго.

Для количественного определения белка измеряют оптическую плотность раствора при 540 нм и сравнивают с калибровочной кривой, построенной по растворам белка с известной концентрацией (например, бычьего сывороточного альбумина).

¶Чувствительность и ограничения

Чувствительность биуретовой реакции относительно невысока по сравнению с другими методами определения белка (например, методом Лоури или Bradford). Минимальная определяемая концентрация составляет примерно 0,5–1 мг/мл белка. Это ограничивает применение метода для анализа сильно разбавленных растворов, но делает его удобным для работы с концентрированными образцами.

Метод имеет ряд ограничений:

• реакцию дают не только белки, но и другие соединения с двумя и более пептидными связями (полипептиды, некоторые амиды);
• присутствие солей аммония, трис-буфера и некоторых других веществ может мешать определению;
• ионы меди в щелочной среде могут гидролизоваться с образованием осадка гидроксида меди, что требует соблюдения точных пропорций реактивов.

¶Применение

Биуретовая реакция широко используется в биохимической практике и клинической лабораторной диагностике. Основные области применения:

• определение общего белка в сыворотке крови и других биологических жидкостях (один из стандартных методов клинической биохимии);
• контроль эффективности выделения и очистки белков в ходе лабораторных работ;
• оценка концентрации белка в пищевых продуктах и кормах;
• демонстрационный опыт в учебных курсах по биохимии и органической химии.

В клинических лабораториях биуретовый метод автоматизирован и входит в состав стандартных биохимических анализаторов. Несмотря на появление более чувствительных методов, он остаётся референтным для определения общего белка благодаря своей простоте, воспроизводимости и независимости от аминокислотного состава белка.

¶Историческая справка

Впервые реакция биурета с сульфатом меди в щелочной среде была описана в 1833 году, когда было установлено, что биурет (H₂N−CO−NH−CO−NH₂) образует фиолетовое окрашивание с солями меди. Позднее, в начале XX века, было показано, что аналогичную реакцию дают белки и пептиды, что привело к разработке метода их обнаружения. В 1912 году польский биохимик Леон Мархлевский предложил использовать биуретовую реакцию для количественного определения белка, а в 1940-х годах метод был стандартизирован для клинического применения.

¶Источники

• Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. — М.: Мир, 1991.
• Комов В. П., Шведова В. Н. Биохимия. — М.: Дрофа, 2004.
• Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. — М.: Мир, 1980.
• Северин Е. С. Биохимия. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015.