ДНК-микрочипы

ДНК-микрочип (также ДНК-биочип, ДНК-чип, олигонуклеотидный микрочип) — это миниатюрное устройство, представляющее собой твёрдую подложку (обычно стеклянную, кремниевую или пластиковую), на поверхности которой в строго определённом порядке (в виде матрицы) иммобилизованы фрагменты одноцепочечной ДНК (зонды) известной последовательности. ДНК-микрочипы используются для одновременного анализа экспрессии тысяч генов, выявления однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), генотипирования, обнаружения мутаций и идентификации патогенных микроорганизмов. Принцип работы основан на гибридизации — комплементарном связывании меченых целевых нуклеиновых кислот из исследуемого образца с иммобилизованными зондами.

История

Разработка технологии ДНК-микрочипов началась в конце 1980-х годов. В 1989 году группа под руководством Эдвина Саузерна (Великобритания) предложила метод нанесения ДНК-зондов на твёрдую подложку с помощью роботизированного печатающего устройства. В 1991 году Стивен Фодор и его коллеги из компании Affymetrix (США) разработали технологию фотолитографического синтеза олигонуклеотидов непосредственно на поверхности чипа, что позволило создавать массивы высокой плотности (до 10⁶ зондов на см²). Первый коммерческий ДНК-микрочип Affymetrix GeneChip был выпущен в 1996 году.

В 1997 году Патрик Браун (Стэнфордский университет) описал метод изготовления микрочипов с использованием роботизированного нанесения кДНК-зондов, что сделало технологию доступной для академических лабораторий. К началу 2000-х годов ДНК-микрочипы стали стандартным инструментом в геномике, а к 2010-м годам — в клинической диагностике и судебно-медицинской экспертизе.

Устройство и принцип работы

Конструкция

ДНК-микрочип состоит из следующих компонентов:

• Подложка — твёрдая основа (стекло, кремний, полимер), обеспечивающая механическую прочность и химическую инертность.
• Зонды — короткие (обычно 20–70 нуклеотидов) или длинные (сотни нуклеотидов) одноцепочечные фрагменты ДНК, иммобилизованные на поверхности. Зонды могут быть синтезированы химически (олигонуклеотиды) или получены методом ПЦР (кДНК).
• Матрица — упорядоченное расположение зондов в виде прямоугольной или гексагональной решётки. Каждый зонд занимает определённую ячейку (спот), координаты которой известны.

Принцип гибридизации

Исследуемый образец (например, тотальная РНК из клеток) обрабатывают для получения фрагментов ДНК или кДНК, которые затем метят флуоресцентными красителями (например, Cy3 и Cy5). Меченые фрагменты наносят на микрочип и инкубируют в условиях, способствующих гибридизации (обычно при 42–65 °C в буферном растворе). Если последовательность целевой ДНК комплементарна зонду, происходит образование двуцепочечного гибрида. После отмывки несвязавшихся фрагментов интенсивность флуоресценции в каждой ячейке измеряют с помощью лазерного сканера. Уровень сигнала пропорционален количеству целевых молекул в образце.

Типы микрочипов

По способу изготовления и типу зондов различают:

Применение

Фундаментальные исследования

• Анализ экспрессии генов — одновременное измерение уровня транскрипции тысяч генов в различных тканях, клеточных линиях или при разных условиях (например, при воздействии лекарств). Позволяет выявлять гены, дифференциально экспрессирующиеся в норме и патологии.
• Генотипирование — определение вариантов последовательности ДНК (SNP, инделы) в геноме человека, животных или растений. Используется в популяционной генетике, эволюционной биологии и селекции.
• Сравнительная геномная гибридизация (CGH) — выявление хромосомных аномалий (делеций, дупликаций, амплификаций) в опухолевых клетках. Широко применяется в онкогенетике.

Медицина

• Диагностика наследственных заболеваний — обнаружение мутаций, вызывающих муковисцидоз, гемохроматоз, наследственные формы рака (BRCA1/BRCA2) и другие моногенные болезни.
• Онкодиагностика — классификация опухолей по профилю экспрессии генов (например, в раке молочной железы — тест MammaPrint), выявление прогностических и предиктивных маркеров.
• Фармакогеномика — определение генетических вариантов, влияющих на метаболизм лекарств (например, CYP2D6, CYP2C19), для подбора индивидуальной терапии.
• Инфекционная диагностика — идентификация патогенов (вирусов, бактерий, грибов) и определение их устойчивости к антибиотикам. Например, микрочипы для выявления вирусов гепатита B и C, ВИЧ, туберкулёза.

Криминалистика и судебная медицина

• ДНК-идентификация личности — анализ SNP-маркеров для опознания останков или установления родства.
• Определение биогеографического происхождения — использование панелей SNP для оценки этнической принадлежности образца.

Сельское хозяйство и биотехнология

• Генотипирование сельскохозяйственных культур — отбор сортов с желаемыми признаками (урожайность, устойчивость к болезням).
• Ветеринарная диагностика — выявление инфекционных заболеваний у животных.
• Контроль качества пищевых продуктов — обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО) или патогенных микроорганизмов.

Преимущества и ограничения

Преимущества

• Высокая производительность — одновременный анализ до 10⁶ зондов на одном чипе.
• Минимальный объём образца — достаточно 1–100 нг тотальной РНК или ДНК.
• Воспроизводимость — стандартизированные протоколы и коммерческие наборы обеспечивают сопоставимость результатов между лабораториями.
• Широкая доступность — коммерческие микрочипы для многих модельных организмов (человек, мышь, дрозофила, арабидопсис).

Ограничения

• Зависимость от известных последовательностей — зонды могут быть созданы только для генов или вариантов, последовательность которых уже известна.
• Перекрёстная гибридизация — гомологичные последовательности (например, члены мультигенных семейств) могут давать ложные сигналы.
• Сложность анализа данных — требуется биоинформатическая обработка: нормализация, коррекция фона, статистическое тестирование.
• Высокая стоимость — особенно для заказных микрочипов и сканирующего оборудования.
• Технические ограничения — чувствительность к качеству РНК, условиям гибридизации и отмывки.

Сравнение с альтернативными методами

С появлением технологий секвенирования нового поколения (NGS) ДНК-микрочипы частично утратили лидирующие позиции в анализе экспрессии генов и генотипировании. Однако они сохраняют преимущества в задачах, требующих высокой пропускной способности при низкой стоимости на образец (например, скрининг SNP в больших популяциях) или при работе с деградированной ДНК (судебная экспертиза). В клинической диагностике микрочипы по-прежнему широко используются для анализа хромосомных аномалий (CGH-микрочипы) и определения фармакогенетических маркеров.

Интересные факты

• Первый ДНК-микрочип Affymetrix GeneChip содержал около 260 000 зондов и использовался для анализа экспрессии генов дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
• Технология фотолитографического синтеза олигонуклеотидов на чипе была заимствована из микроэлектроники и адаптирована для биологических целей.
• В 2015 году компания Affymetrix была приобретена Thermo Fisher Scientific (США) за 1,3 миллиарда долларов.
• ДНК-микрочипы используются в космической биологии: например, на Международной космической станции проводились эксперименты по изучению влияния микрогравитации на экспрессию генов у дрожжей и бактерий.
• В России разработкой ДНК-микрочипов занимаются в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (Москва) и в Институте цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск).

Источники

• Schena M., Shalon D., Davis R.W., Brown P.O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science, 1995, 270(5235): 467–470.
• Fodor S.P., Read J.L., Pirrung M.C., et al. Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science, 1991, 251(4995): 767–773.
• Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology, 1975, 98(3): 503–517.
• Affymetrix. GeneChip Expression Analysis Technical Manual. Santa Clara, CA, 2004.
• Illumina. Infinium HD Assay Protocol Guide. San Diego, CA, 2012.
• Pollack J.R., Perou C.M., Alizadeh A.A., et al. Genome-wide analysis of DNA copy-number changes using cDNA microarrays. Nature Genetics, 1999, 23(1): 41–46.
• Лихошвай В.А., Матвеева Н.М., Рязанцев Д.Ю. и др. ДНК-микрочипы: принципы, технологии, применение. Молекулярная биология, 2008, 42(6): 1008–1020.